Работа № 4. Осаждение белков органическими кислотами.

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 29Следующая ⇒

Некоторые органические кислоты вызывают необратимые осаждение белков. Клинико-диагностическое значение: сульфосалициловая кислота используются для обнаружения малых количеств белка в биологических жидкостях (спино-мозговой жидкости, моче, экссудатах). Трихлоруксусная кислота используется для получения безбелкового фильтрата крови в лабораторной практике.

Ход работы. К 0, 5-1, 0 мл раствора белка добавить равный объем 10% раствора сульфасалициловой кислоты или 5% раствора трихлоруксусной кислоты. Отметить выпадение белого осадка.

Сульфосалициловая кислота

Работа № 5. Осаждение белков концентрированной азотной кислотой (проба Геллера).

Выпадение белка в осадок при действии некоторых минеральных кислот связано с дегидратацией белковых частиц и образованием комплексных солей белка с кислотами. Клинико-диагностическое значение: в избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. Поэтому реакция осаждения белков азотной кислотой используется для качественного, а также для количественного (см. ниже) анализа мочи (проба Геллера).

Ход работы. К 1 мл концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки, наклонив ее под углом 45⁰ так, чтобы обе жидкости сразу не смешивались, наслоить равный объем раствора белка.

На границе двух жидкостей образуется осадок в виде белого кольца.

По работе сделать вывод.

Работа № 6. Количественное определение белка в моче по методу

Брандберга-Робертса-Стольникова.

Клинико-диагностическое значение. В норме моча не содержит белка в количестве, обнаруживаемом обычными химическими методами. Белок в моче появляется при заболеваниях почек, при нарушении белкового состава крови.

Принцип метода. В основе метода лежит проба Геллера – денатурация белка азотной кислотой. Экспериментально установлено, что при наслаивании на азотную кислоту, растворы, содержащие 0, 0033% белка, дают белое колечко в промежутке между второй и третьей минутами после наслаивания. Если колечко появляется непосредственно после наслаивания раствора белка на азотную кислоту, то путем последовательного разведения исследуемого материала достигают такого максимального разведения, при котором появляется кольцо между второй и третьей минутами. Умножая разведение на 0, 0033%, получается процентное содержание белка в моче.

Ход работы. Приготовить 2 ряда пробирок (по 8 в каждом). Во все пробирки первого ряда прилить по 1 мл концентрированной азотной кислоты.

В пробирках второго ряда развести исследуемую мочу методом кратных разведений. Для этого в первую пробирку и вторую пробирки этого ряда налить по 1 мл исследуемой мочи, во вторую и все последующие - по 1 мл дистиллированной воды.

После перемешивания из второй пробирки перенести 1мл жидкости в третью, затем после перемешивания такой же объем из третей пробирки перенести в четвертую и т.д. до конца ряда. Из последней пробирки 1мл жидкости вылить. Таким образом, получается следующий ряд разведений исследуемой мочи: в первой пробирке моча исходной концентрации, во 2-ой – разведена в 2 раза, в 3-ей – в 4 раза, в 4-ой – в 8 раз, в 5-ой - в 16, в 6-ой - в 32, в 7-ой – в 64, в 8-ой – в 128.

После разведения мочи произвести поочередное наслаивание содержимого каждой пробирки на концентрированную азотную кислоту. По секундомеру отметить, в какой пробирке белое кольцо образовалось через 2-3 минуты после начала опыта.

Примерный расчет. Между 2-ой и 3-ей минутами белое кольцо образовалось в 5-ой пробирке, где разведение мочи 1: 16.

Следовательно, концентрация белка в исходной порции мочи равна:

0, 0033% × 16 = 0, 05%

УИРС. Качественное и количественное исследование мочи на содержание белка. Сравнение результатов количественного определения белка в моче сульфосалициловым методом и методом Брандберга-Робертса-Стольникова.

1. Доказать наличие белка в моче с помощью проб, основанных на коагуляции белка химическими реактивами: пробой Геллера (см. выше) и с помощью р-ра сульфосалициловой кислоты (ССК).

Сульфосалициловая проба. Условия опыта. Моча должна быть кислой (рН5, 0-6, 5). Щелочную мочу подкисляют 10% р-ром уксусной кислоты. Излишек кислоты, как и щелочная реакция, приводят к ложноотрицательной пробе (объяснить механизм). К 2-3 мл мочи добавляют 4-6 капель 20% р-ра сульфосалициловой кислоты. При наличии белка моча мутнеет.

2. Сульфосалициловый метод количественного определения белка в моче. Ход работы. В пробирку вносят 5 мл 3% р-ра ССК и добавляют 1, 25мл профильтрованной мочи, смешивают. Через 5 мин колориметрируют при длине волны 590-650 нм (оранжевый или красный светофильтр) против контроля в кювете на 5 мм. Контроль содержит 5мл 0, 9% р-ра хлорида натрия. Интенсивность помутнения при коагуляции белка ССК пропорциональна его концентрации.

По калибровочному графику находят содержание белка в моче.

3. Определить содержание белка в том же материале с помощью метода Брандберга-Робертса-Стольникова, как описано выше. Сравнить полученные результаты. Сделать вывод.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1. А. –б; 1.1. Б. – а.

1.2. – г (включение пролина вызывает изгиб полипептидной цепи, делая невозможным вращение вокруг связи между a-углеродным атомом и азотом иминогруппы);

1.3. – в (гидрофобные радикалы прячутся внутри частицы белка);

1.4. – а (рI_асп+ рI_лиз/2).

Вид 2. 2.1. – 1-а, 2-б, 3-в, 4-г; 5-е, 6-ж, 7-д; 2.2. - 1-г, 2-в, 3-б, 4-а.

Вид 3. 3.1. - 4; 3.2. –4; 3.3. – 4; 3.4. – 2, 4.

Вид 4. 4.1. –Д (-, +, -), 4.2 –Е (-, -, -), 4.3 – С (+, -, -).

⇐ Предыдущая 1 234 5 6 7 8 9 10 Следующая ⇒