Работа № 3. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле

⇐ ПредыдущаяСтр 10 из 29Следующая ⇒

Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе.

Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана.

Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов №1, №2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1: 2: 4: 1. смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку.

Приготовленную полимеризующую смесь разливают в стеклянные трубочки, используя по 2 мл на каждую. Затем на поверхность этого раствора осторожно наслаивают 0, 2-0, 3 мл дистиллированной воды пипеткой с тонким оттянутым концом (это улучшает полимеризацию геля в трубочках, которая протекает без доступа кислорода воздуха, и формирует гладкую поверхность геля). Через 30 мин обычно полимеризация завершается, о чем свидетельствует ясно различимая граница между полиакриламидным гелем и водой. После этого переворачивают трубочки и осторожно стряхивают с геля наслоенную воду, а остатки воды удаляют из трубочки с помощью фильтровальной бумаги.

Стеклянные трубочки с заполимеризованным гелем закрепляют в гнездах верхней камеры для электрофореза. На поверхность геля в трубочке наносят сначала 0, 1 мл сыворотки крови, затем такой же объем раствора сахарозы и перемешивают нанесенные жидкости стеклянной палочкой. Осторожно наслаивают на эту жидкость разведенный в 10 раз электродный буфер, заполняя им пространство до верхнего края трубочки.

Нижнюю камеру аппарата заливают тем же электродным буфером, устанавливают верхнюю камеру над нижней так, чтобы нижние концы трубочек были погружены в электродный буфер. Затем верхнюю камеру тоже заполняют электродным буфером.

Аппарат для электрофореза ставят в холодильник. Электроды подключают к источнику постоянного напряжения: нижний электрод к аноду, верхний - к катоду. В течение первых 10 мин электрофорез проводят при силе тока 2мА на каждую трубочку. Затем силу тока увеличивают до 4мА. Длительность электрофореза около 90 мин.

Пока идет электрофорез, для выявления изоферментов ЛДГ готовят в колбе инкубационную смесь следующего состава: растворы лактата натрия, хлорида натрия, хлорида магния, НАД – по 1 мл, фосфатного буфера и НС- по 2, 5 мл и ФМС – 0, 25 мл, перемешивают содержимое колбочки.

По окончании электрофореза гели извлекают из трубочек. Для этого используют шприц на 10-20 мл с тонкой длинной иглой. Вводят иглу между стенкой трубочки и гелем. Круговыми движениями отслаивают гель, постоянно выдавливая воду из шприца и продвигая иглу к противоположному концу трубки. При этом столбик геля легко выскакивает из трубки.

Столбик геля помещают в пробирки диаметром 7-8мм и наливают в них инкубационную смесь так, чтобы весь столбик геля был погружен в проявляющуюся жидкость. Пробирки ставят в термостат при 37⁰С на 40-60 мин. Изоферменты ЛДГ выявляются в виде сине-фиолетовых колец на столбике геля.

По истечении инкубации столбики геля промывают водой, переносят в пробирки содержащие раствор уксусной кислоты, и хранят в темноте.

Количественную обработку гелевых изоэнзимограмм проводят спектрофотометрическим методом или посредством денситометрии. В первом случае лезвием вырезают окрашенные участки геля, помещают их в пробирки и заливают 1 мл подогретого до +80-85⁰С раствора диметилформамида. Затем окрашенную жидкость сливают в микрокюветы и измеряют экстинкцию на спектрофотометре или ФЭКе при 540 нм против раствора диметилформамида.

Второй способ обработки заключается в сканировании гелей на микроденситометре. Денситограммы подвергаются количественной обработке.

Расчет. Относительную активность каждого изофермента х (%) выражают в процентах от суммы экстинкций всех изоферментов ЛДГ:

Х=ЕА× 100%

∑ Е, где Е- экстинкция элюата изофермента из зоны геля, относящейся к данному изоферменту; ∑ Е- сумма экстинкций всех изоферментов; А- активность ЛДГ сыворотки крови, ммоль/(ч·л).

Оформление работы. Зарисовать полученную изоэнзимограмму и рассчитать относительную активность изоферментов ЛДГ (в %). Сделать вывод о сдвигах спектра изоферментов ЛДГ в исследуемой сыворотке и указать на вероятные причины этого явления.

Клинико-диагностическое значение. Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментого спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом тканей и органов. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ₁и ЛДГ₂ (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ₃, а в скелетной мышце и печени-ЛДГ₄и ЛДГ₅(изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ₁-31, ЛДГ₂-47, ЛДГ₃-12, ЛДГ₄-5, ЛДГ₅- 4. При инфаркте миокарда увеличивается доля ЛДГ₁и ЛДГ₂(спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови.

При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ₄и ЛДГ₅. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени.

При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ₃ в сыворотке крови. Увеличение активности изоферментов средней зоны ЛДГ₃ и ЛДГ₄ наблюдается также при массивном разрушении тромбоцитов (эмболии легочной артерии, массивные гемотрансфузии) и вовлечении в патологический процесс лимфатической системы.

УИРС. Исследование амилазной активности мочи.

Исследование амилазной активности мочи по Вольгемуту производится аналогично методике приведенной выше для определения активности амилазы слюны). Амилазная активность мочи также отражает и величину клубочковой фильтрации. Снижение активности этого фермента в моче наблюдается при почечной недостаточности. В норме амилазная активность мочи по Вольгемуту составляет от 16 до 64 Е.

Для определения активности амилазы можно использовать также модификацию Бюхнера. По данному методу амилазная активность мочи выражается количеством фермента, расщепляющим 2 мг крахмала за 15 мин.

Ход работы. На сухую чашку Петри заранее капают в разных местах по 1 капле раствора Люголя (всего 8-10 капель). В пробирку вносят 2 мл 0, 1% р-ра крахмала (2 мг крахмала), 1 мл физиологического р-ра и помещают пробирку на водяную баню при 37°С на 2 мин. Через 2 мин, не вынимая пробирку из бани, добавляют в нее 05 мл мочи, перемешивают и отмечают время начала реакции. Затем каждые 2-3 мин переносят каплю реакционной смеси на чашку Петри в раствор Люголя до тех пор, пока не произойдет полное разложение крахмала, т.е. до появления желтого цвета

Активность амилазы рассчитывают по формуле:

Х_ед=15/Т× 0, 5,

где х- активность амилазы в 1 мл мочи;

15 – время, необходимое для полного расщепления 2 мг крахмала;

0, 5 – количество мочи, взятое на анализ, мл;

Т- время реакции, мин.

В норме активность амилазы мочи по Бюхнеру составляет 1-2 ЕД.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1. – в; 2 –а.

Вид 2. 2.1. 1-В; 2-г; 3-а; 4-д; 5-б;

2.2. 1-а; 2-б; 3-в;

2.3. 1-е; 2- а, б; 3-г; 4-г; 5-д; 6-а, б, в.

Вид 3. 3.1.- 4; 3.2.- 1, 2, 3.

Вид 4. 4.1.- А (+, +, +); 4.2.- С (+, -, -).

⇐ Предыдущая 5 6 7 8 91011 12 13 14 Следующая ⇒