Работа № 1. Количественное определение протеолитической активности желудочного сока по Ансену.

⇐ ПредыдущаяСтр 18 из 29Следующая ⇒

Принцип метода. О протеолитической активности желудочного сока судят по количеству образующихся при расщеплении казеина неосаждаемых ТХУ пептидов, концентрация которых соответствует концентрации определяемого в них тирозина.

Техника выполнения работы. В две центрифужные пробирки отмерить по 1 мл желудочного сока, разведенного в 10 раз. В опытную пробирку добавить 1 мл 5 % раствора казеината натрия, в контрольную – 2 мл 5 % ТХУ. Содержимое пробирок перемешать, поместить в термостат при температуре 38° С на 20 мин. После термостатирования в контрольную пробу добавить 1 мл 5 % раствора казеината натрия, в опытную – 2 мл 5 % ТХУ. Выдержать 15 мин, далее центрифугировать 15 мин при 3000 об/мин. После этого отобрать в 2 биологические пробирки по 1 мл центрифугата (надосадочной жидкости) и по 5 мл 0, 5 н раствора Na₂CO₃. При перемешивании в обе пробирки добавить по 1 мл реактива Фолина и выдержать 20 мин.

Оптическую плотность опытного раствора измерить на ФЭКе при длине волны 760 нм (красный светофильтр) в кювете толщиной 10 мм против контроля. Концентрацию тирозина (С_тир) найти по калибровочному графику. Рассчитать активность по формуле:

А= 2× С_тир (мкМ/мл мин).

В норме протеолитическая активность желудочного сока равна 0, 15-0, 5 мкМ/мл мин.

Работа №2. Определение активности уропепсина.

Метод основан на способности пепсина в определенных условиях расщеплять белковую молекулу гемоглобина с освобождением тирозина и триптофана. По концентрации последних судят о пептической активности желудочного сока или мочи. Около 1% пепсиногена, вырабатываемого клетками слизистой оболочки желудка, поступает в кровь и выводится почками с мочой в виде уропепсиногена.

Техника проведения работы. Определение уропепсина.

Из суточного количества мочи отбирают 20 мл, помещают в градуированный цилиндр, подкисляют раствором соляной кислоты до pH 1, 5 и доводят дистиллированной водой до 25 мл. Таким же путем доводят раствор гемоглобина до pH 1, 5. В пробирку отмеривают 1 мл подкисленной мочи, добавляют 5 мл раствора гемоглобина, перемешивают и выдерживают на водяной бане при 37* в течение 30 мин. Затем добавляют 10 мл 5% раствора ТХУ, перемешивают, фильтруют и в фильтрате определяют тирозин. Для этого к 2 мл фильтрата добавляют 5 мл дистиллированной воды, 8 мл раствора щелочи и 3 мл реактива Фолина, предварительно разведенного водой в 3 раза. После добавления последнего развивается голубая окраска. Через 30 мин на ФЭКе определяют оптическую плотность при длине волны 580 нм. Опыт сравнивают с контролем, в контроле моча заменяется дистиллированной водой. Расчет содержания пепсиногена в суточном количестве мочи производят по формуле:

П сут =20× Д× V× X (Ед/24часа),

где Д- оптическая плотность опытного раствора; X- количество тирозина в мг, которое определено по калибровочной кривой; V- объем мочи за 24 часа.

Определение пепсина в желудочном соке производят аналогичным способом, с той лишь разницей, что для исследования берут 5 мл желудочного сока. Расчет производят на 100 мл желудочного сока.

Эталоны ответов на тесты

Вид 1. 1.1. – б, е; 1.2 - б.

Вид 2. 2.1. 1- б, в, г; 2- а, д, ж; 3-е; 2.2. 1- в, г; 2 – а, б, д.

Вид 3. 3.1. 1 –а, 2 – б; 3.2. 4 – а, 1 – б, 2, 3 – в.

Вид 4. 4.1. С (+, -, -); 4.2 Д (-, +, -).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Острый панкреатит. Аутолиз (самопереваривание) ткани поджелудочной железы протеолитическими ферментами.

Задача 2. 1) пепсин расщепит химотрипсин;

2) химотрипсин расщепит пепсин;

3) ничего не произойдет.

Задача 3. 100г белка содержат 15 г N

60 г белка содержат: 60× 15/100=9 г N

С мочой выделяется 14 г азота, поступает с пищей 9 г азота. Отрицательный азотистый баланс.

Занятие № 2. Обмен аминокислот. Обезвреживание аммиака.

Цель занятия. Усвоить пути превращения аминокислот, углубить и закрепить знания о способах обезвреживания аммиака в тканях.

Студент должен
знать:	уметь:
1. Особенности тканевого распада белков. 2. Общие пути метаболизма аминокислот: переаминирование, дезаминирование, декарбоксилирование. 3. Особенности обмена ароматических и серусодержащих аминокислот. 4. Процессы связывания аммиака в тканях и его детоксикацию в печени и почках.	1. Представить реакции переаминирования, дезаминирования, декарбоксилирования аминокислот. Объяснить биологическую роль образующихся аминов. 2. Охарактеризовать причины и последствия развития фенилкетонурии, алкаптонурии, альбинизма. 3. Объяснить процессы детоксикации аммиака.

Содержание занятия.

Студентам предстоит пройти проверку выполнения заданий по самоподготовке, дать ответы на тесты контроля исходного уровня знаний и вопросы преподавателя, решить ситуационные задачи, прослушать доклад по теме УИРС, овладеть методами определения активности АСТ и АЛТ, а также определения содержания мочевины в моче.

Методические указания к самоподготовке

При подготовке к занятию, используя лекции, учебники и дополнительную литературу, выполните следующие задания:

№№	Задание	Указания к выполнению задания

1.	Вспомните структуру и свойства аминокислот.	А. Напишите структуру моноаминомонокарбоновых аминокислот. Б. Напишите структуру ароматических и гетероциклических аминокислот. В. Напишите структуру моноаминодикарбоновых и диаминомонокарбоновых аминокислот.
2.	Изучите общие пути превращений аминокислот в тканях.	А. Дайте определение понятию «клеточный метаболический фонд аминокислот». Б. Зарисуйте схему основных путей поступления и использования аминокислот в клетке.
3.	Изучите процессы переаминирования, дезаминирования и декарбоксилирования аминокислот.	А. Представьте общую схему процесса переаминирования. Б. Вспомните структуру пиридоксальфосфата и напишите молекулярный механизм переаминирования. В. Объясните биологический смысл переаминирования и его роль во взаимосвязи обмена аминокислот с углеводами, липидами, циклом трикарбоновых кислот. Г. Напишите названия глюкогенных и кетогенных аминокислот. Д. Охарактеризуйте типы дезаминирования в живых системах. Е. Напишите схему действия глутаматдегидрогеназы Ж. Напишите непрямое дезаминирование аланина, аспартата, серина. З. Напишите реакции декарбоксилирования гистидина, триптофана, лизина, глутамата. Охарактеризуйте биологические эффекты образующихся аминов. И. Напишите схему инактивации аминов в организме.
4.	Изучите пути обезвреживания аммиака в организме.	А. Напишите реакции синтеза и распада глутамина. Б. Представьте схему выведения аммиака с мочой. В. Нарисуйте схему взаимосвязи между орнитиновым циклом и циклом трикарбоновых кислот. Г. Объясните, какие соединения являются донорами первого и второго атомов азота при синтезе мочевины. Напишите реакции орнитинового цикла с участием этих соединений.
5.	Изучите процессы обмена некоторых аминокислот.	А. Представьте схему метаболизма ароматических аминокислот. Назовите биохимические дефекты при фенилкетонурии, альбинизме, алкаптонурии. Б. Напишите примеры реакций метилирования с участием S-аденозилметионина. В. Напишите структуру глутатиона и укажите его биологическую роль. Г. Представьте схему превращений цистеина и глицина.

Примеры тестов для контроля исходного уровня знаний

Вид 1. Для каждого вопроса выберите наиболее правильный ответ (ответы).

1.1. В состав коферментов декарбоксилаз аминокислот входит….

а) никотинамид б) пиридоксин в) фолиевая кислота

г) тиамин д) рибофлавин е) аскорбиновая кислота

1.2. Непосредственной предшественницей мочевины в орнитиновом цикле является….

а) аспартат б) глутамат в) аргинин г) орнитин д) метионин

Вид 2. Для каждого вопроса, пронумерованного цифрой, подберите ответ, обозначенный буквенным индексом.

2.1.

Фермент	Продукт декарбоксилирования
1. глутаматдекарбоксилаза	А) гистамин
2. гистидиндекарбоксилаза	Б) триптамин
3. триптофандекарбоксилаза	В) ГАМК

2.2.

Субстрат	Продукт декарбоксилирования
1. фенилаланин	А) никотиновая кислота
2. триптофан	Б) серотонин
3. глутамат	В) гомогентизиновая кислота
4. цистеин	Г) таурин
	Д) меланин
	Е) ГАМК

Вид 3. Выберите правильные ответы:

3.1. S-аденозилметионин:

А. Является источником метильной группы в синтезе биологически актив ных веществ.

Б. Инициирует процесс трансляции

В. Участвует в обезвреживании токсических соединений.

Г. Служит источником серы для синтеза цистеина.

Д. Является предшественником гомоцистеина.

3.2. Выполните последовательно задание.

а) Назовите соединение:

1. Гистамин

2. Адреналин

3. ДОФамин

4. Тироксин

5. Норадреналин

б) Это вещество синтезируется из ….

1. гистидина

2. глутаминовой кислоты

3. тирозина

4. фениаланина

5. триптофана

в) Это вещество синтезируется в ….

1. надпочечниках

2. коже

3. печени

4. соединительной ткани

5. щитовидной железе

Вид 4. Определите истинность первой и второй части утверждений и установите наличие или отсутствие между ними логической связи.

4.1. При алкаптонурии нарушен обмен триптофана, потому что при этой патологии отсутствует оксидаза гомогентизиновой кислоты.

4.2. Орнитиновый и трикарбоновых кислот циклы Кребса тесно связаны, потому что у них имеется общий метаболит – фумарат.

Примеры ситуационных задач

Задача 1. При обследовании работницы химчистки было обнаружено увеличение активности АЛТ в крови в 6, а АСТ в 2 раза. Обсуждая эти результаты, врач практикант А. связал активацию ферментов с избыточным употреблением мясных продуктов и решил, что особых причин для беспокойства нет, а нужно сделать повторный анализ. Практикант Б. предложил госпитализировать эту работницу, полагая, что у нее поражение печени органическими растворителями. Кто из врачей-практикантов прав и почему?

Задача 2. У ребенка содержание в крови фенилаланина 5 мкмоль/мл (при норме 0, 2 мкмоль/мл), с мочой выделяется большое количество этой аминокислоты. Назовите заболевание. Какие процессы обмена нарушены, как вскармливать ребенка?

Самостоятельная работа студентов

Работа № 1. Колориметрический метод определения активности аспартат- и аланинаминотрансфераз в сыворотке крови.

Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики болезней печени. Для острого гепатита характерно раннее повышение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ). При инфаркте миокарда в 95 % случаев в сыворотке крови повышается активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ). В сыворотке крови здоровых людей активность АсАТ колеблется в пределах 0, 028-0, 139 мкмоль/л× сек, активность АлАТ – 0, 028-0, 196 мкмоль/л× сек.

Принцип метода. В результате переаминирования при участии АсАТ и АлАТ образуются, соответственно, щавелевоуксусная (ЩУК, оксалоацетат) и пировиноградная (ПВК) кислоты.

СООН СООН СООН СООН

| | | |

СН–NH₂+ C=O C=O + СН–NH₂

| | ← → | |

CH₂(CH₂)₂АсАТ CH₂(CH₂)₂

| | | |

COOH COOH COOH COOH

аспартат α -кетоглутарат оксалоацетат глутамат

СООН СООН СООН СООН

| | | |

СН–NH₂+ C=O C=O + СН–NH₂

| | ← → | |

CH₃(CH₂)₂АлАТ CH₃(CH₂)₂

| |

COOH COOH

аланин α -кетоглутарат пируват глутамат

Оксалоацетат при декарбоксилировании превращается в пируват. При добавлении кислого 2, 4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается и образуется гидразон пировиноградной кислоты. Последний в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты.

Техника выполнения работы.

Определение АсАТ.

Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.

Опытная проба. В пробирку вносят 0, 5 мл субстратного раствора, добавляют 0, 1 мл сыворотки, помещают в термостат при температуре 37° С на 1 час. Затем добавляют 0, 5 мл раствора динитрофенилгидразина и выдерживают при комнатной температуре 20 мин для развития реакции. Затем приливают 5 мл 0, 4 н NaOH, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин для развития окраски. Оптическую плотность измеряют на ФЭКе с зеленым светофильтром в кювете на 10 мм против контроля.

Контрольная проба. Содержит все ингредиенты опытной пробы за исключением сыворотки крови. Вместо нее берут 0, 1 мл дистиллированной воды и инкубируют в тех же условиях, что и опытную.

Определение АлАТ.

Одновременно готовят опытную и контрольную пробы.

В опытную пробирку вносят 0, 5 мл субстратного раствора для определения АлАТ, затем добавляют 0, 1 мл испытуемой сыворотки и помещают в термостат при температуре 37° С на 30 мин. Дальнейший ход анализа такой же, как при определении АсАТ.

В контрольную пробирку вместо сыворотки крови берут 0, 1 мл дистиллированной воды.

Расчет активности ферментов производят по калибровочному графику, отражающему зависимость оптической плотности от содержания ПВК.

⇐ Предыдущая 13 14 15 16 171819 20 21 22 Следующая ⇒