Работа № 5. Обнаружение активности цитохромоксидазы.

При добавлении к срезам тканей α -нафтола и парафенилендиамина происходит окрашивание тканей вследствие образования индофеноловой сини. Эта реакция катализируется цитохромоксидазой.

Химизм реакции:

	цитохромоксидаза   О2
α –нафтол + n-фенилен- диамин		индофеноловая синь

Ход работы. На часовое стекло взять срез свежей ткани, например печени или мышцы, на него нанести по 1 капле 1% спиртового раствора α -нафтола и 1% водного раствора парафенилендиамина. Появление синего окрашивания на срезе ткани указывает на присутствии в ней активной цитохромоксидазы.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1.- а, 2- в, 3- г.

Вид 2. 2.1.: 1-в, 2-а, 3-б, 4-г, 5-в; 2.2.: 1-г, 2-в, 3-а, 4-б;

2.3: 1-а; 2-в; 3-д; 4-б; 5-г; 6-а.

Вид 3. 3.1.- 1, 2, 3; 3.2.- 1, 3; 3.3.- 4.

Вид 4. 4.1.- D (-, +, -); 4.2.- С (+, -, -).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Энергия гидролиза АТФ составляет – 7, 3 ккал/моль, следовательно, гидролиз 12, 5 молекул АТФ высвобождает 12, 5 ´ 7, 3 = 91, 3 ккал/моль энергии, тогда как образование этого количества АТФ требует 273 ккал. Эффективность составляет 91, 3´ 100/273=33, 4%.

Задача 2. В результате альдольной конденсации щавелевоуксусной кислоты и меченого по указанным положениям ацетила образуется лимонная кислота со следующим распределением радиоактивной метки

 

Углеродные атомы, имеющие происхождение из меченого ацетила, в ходе первого оборота цикла окисляться не будут, поэтому радиоактивная метка будет обнаруживаться в центральных атомах регенерированного ЩУК (НООС-¹⁴СН₂¹⁴СО-СООН). В ходе второго оборота, после конденсации ацетила и меченого ЩУК, будет образовываться лимонная кислота:

,

поэтому в ходе второго оборота меченые углероды окислительному декарбоксилированию подвергаться не будут и выделится ЩУК со следующим распределением радиоактивной метки НООС-СН₂¹⁴СО-¹⁴СООН. Таким образом, ¹⁴СО₂ будет выделяться в ходе третьего оборота цикла.

Задача 3. Активность ферментов определяется при концентрациях субстрата, обеспечивающих V max, поэтому состав инкубационной среды по прямой реакции должен содержать субстрат – яблочную кислоту. Достижение V max требует и поддержания оптимального значения рН, следовательно, должен использоваться соответствующий буфер. Вследствие того, что НАД-зависимые дегидрогеназы непрочно связывают кофермент, требуется добавление к среде определения и кофермента – окисленной формы НАД. Для определения активности фермента по обратной реакции (по убыванию светопоглощения) среда будет содержать оксалоацетат, восстанновленный НАД и соответствующий буфер.

 

Занятие № 5. Тканевое дыхание. Окислительное фосфорилирование (cеминар).

Цель занятия. Усвоить узловые вопросы сопряженного и свободного окисления, закрепив представления о связи энергетического обмена с анаболическими и катаболическими процессами обмена веществ в клетках, студент должен:

 

знать:

уметь:

1. Биологическое окисление в дыхательной цепи митохондрий, связь его с синтезом АТФ. 2. Окислительное фосфорилирование, его количественная характеристика, хемиосмотическая теория сопряжения дыхания и фосфорилирования. 3. Разобщение тканевого дыхания и фосфорилирования. Терморегуляторная функция тканевого дыхания. Особенности окисления в буром жире, значение процессов окисления в буром жире для младенцев.

1. Написать схему полной и укороченной дыхательной цепи митохондрий, включающую дыхательные комплексы I – IV, пункты сопряжения с фосфорилированием АДФ. 2. Написать схему перепада редокс-потенциалов компонентов цепи переноса электронов (ЦПЭ) от субстратов на кислород. 3. Объяснить механизм сопряжения дыхания и фосфорилирования, различия величин коэффициента P/O для субстратов пиридиновых (НАД-зависимых) и флавиновых (ФАД-зависимых) дегидрогеназ ЦПЭ. 4. Вычислить энергетическую эффективность (выход АТФ) процессов: цикла трикарбоновых кислот, полного окисления пирувата. 5. Объяснить механизмы разобщения дыхания и фосфорилирования; терморегуляторную функцию тканевого дыхания бурого жира, значение процессов окисления в буром жире для младенцев.

План занятия

1. Контроль выполнения задания по самоподготовке, ответы на тесты.

2.Рассмотрение узловых вопросов, решение ситуационных задач, заслушивание и обсуждение реферативных сообщений.

Методические указания к самоподготовке

При подготовке к семинару обобщите свои представления об обмене веществ и энергии в организме. Обратите внимание на единство структуры и функции митохондрий, на высокую специализацию различных оксидоредуктаз клетки, принимающих участие в процессах тканевого дыхания и биологического окисления.

Необходимо знать структуру и биологическую роль макроэргических соединений, иметь четкие представления о последовательности реакций процессов тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования, свободного окисления. Знание узловых вопросов энергетического обмена совершенно необходимо для усвоения всех последующих разделов биохимии, для понимания различных физиологических процессов, как в норме, так и при патологии, а также при изучении молекулярных основ действия ряда фармакологических средств.

Для логического усвоения темы выполните следующие задания.

№№	Задание	Указания к выполнению задания
1.	Внимательно прочитайте историю развития представлений о дыхании и биологическом окислении.	1. Кратко законспектируйте из учебника содержание гипотез и теорий Лавуазье и Шейнбайха, Баха, Палладина, Виланда. 2. Что мы понимаем под процессами биологического окисления и тканевого дыхания в настоящее время?
2.	Изучите механизм биологического окисления в дыхательной цепи ферментов внутренней мембраны митохондрий и его связи с процессами синтеза АТФ.	1. Схематически представьте последовательность ферментов дыхательной цепи во внутренней мембране митохондрий (полной и короткой). 2. Укажите дыхательные комплексы и участки переноса водорода и раздельного транспорта электронов и протонов. 3. Выделите пункты наибольшей разности редокс-потенциалов ферментов дыхательной цепи количество энергии, выделяемой в этих пунктах в кДж/моль. 4. Схематически изобразите строение митохондрии и «элементарных частиц» внутренней мембраны, указав расположение ферментов дыхания и АТФ-синтетазы. 5. Сформулируйте смысл концепции электрохимического механизма окислительного фосфорилирования (Митчелл). 6. Укажите на изображенной вами схеме дыхательной цепи пункты сопряжения окисления и фосфорилирования. 7. Имейте четкое представление о смысле стехиометрического коэффициента P/O. Рассчитайте значение коэффициента P/O при окислении яблочной и при окислении янтарной кислот. 8. Дайте определению понятию «разобщение», выпишите примеры разобщителей. 9. Объясните, почему цикл трикарбоновых кислот называют основным энергетическим котлом. При этом рассчитайте, сколько восстановленных коферментов образуется при окислении одного остатка уксусной кислоты и какое количество АТФ может синтезироваться в процессах окислительного фосфорилирования. 10. Дайте объяснение биологическому смыслу теснейшей взаимосвязи цикла трикарбоновых кислот и окислительного фосфорилирования. 11. Дайте определению понятию «субстратное фосфорилирование». Выпишите пример реакции субстратного фосфорилирования, протекающей в цикле Кребса.
3.	Разберите понятие: дыхание и гипоксия.	1. Из каких процессов складывается система дыхания животного организма: 1, 2, 3. 2. Рассмотрите цепь переноса электронов, как часть системы тканевого дыхания. Что такое дыхательный контроль? 3. Дайте объяснение терморегуляторной функции тканевого дыхания. Выделите особенности окисления и функции бурого жира, значение процессов окисления в буром жире для младенцев. 4. Дайте понятие респираторной, гемической и тканевой гипоксии.

Примеры тестовых заданий контроля исходного уровня знаний

Вид 1. Выбор одного наиболее верного ответа

1.1. Бурая жировая ткань

а) в больших количествах присутствует у взрослых, чем у детей

б) содержит большее число митохондрий, по сравнению с белой жировой тканью

в) проявляет высокую степень сопряжения между окислением и фосфорилированием

 

1.2. Добавление 16 мкмоль фосфата к препарату митохондрий вызывает поглощение 8 мкатомов кислорода

А. коэффициент окислительного фосфорилирования

а) 2 б) 3 в) 4 г) 1

Б. Наиболее вероятный субстрат дыхания

а) малат б) a-кетоглутарат с) сукцинат

 

1.3. Какая редокс-пара дыхательной цепи включает донор протонов и электронов и акцептор только электронов?

а) восстановленный коэнзим Q и окисленный цитохром b

б) восстановленные железосерные белки и окисленный убихинон

в) восстановленный флавопротеин и окисленный железосерный центр

г) восстановленный цитохромоксидаза и молекулярный О₂.

1.4. Какое из перечисленных утверждений относительно компонентов электронтранспортной цепи является верным?

а) кислород непосредственно окисляет цитохром c

б) сукцинатдегидрогеназа непосредственно восстанавливает цитохром c

в) часть белковых компонентов дыхательной цепи кодируются ядерной, а часть митохондриальной ДНК

г) цианиды разобщают окисление и фосфорилирование

Вид 2. Установить соответствие.

2.1. Дайте определение перечисленным типам окисления:

1. окисление не связанное с синтезом АТФ

2. окисление субстратов в дыхательной цепи одновременной с аккумуляцией энергии в связях АТФ

3. синтез АТФ за счет энергии квантов света

4. монооксигеназное окисление соединений, связанное с их одновременным гидроксилированием

5. окисление, связанное с накоплением энергии в связях АТФ

а) сопряженное окисление

б) свободное окисление

в) сопряженное окисление (фотосинтез)

2.2. Тип реакции окисления – схема реакции

1. пероксидазный а) RH+O₂ ® ROOH

2. оксидазный б) SH₂ +1/2 O₂ ® S+ H₂O

3. монооксигеназный в) S+ O₂ ® SO₂

4. ПОЛ г) RH₂+O₂+ SH® R+SOH+ H₂O

5. диоксигеназный д) SH₂ +O₂ ® S+ H₂O₂

2.3. Фермент – катализируемая реакция

1. супероксиддисмутаза а) 2GSH+ROOH®GSSG+ROH+ H₂O

2. глутатионпероксидаза б) H₂O₂ ® H₂O+ O₂

3. каталаза в) O₂^- + O₂^- + H⁺® H₂O₂+ H₂O₂

4. глутатионредуктаза г) GSSG+NADPH+H⁺®GSH+NADP⁺

Вид 3.

3.1. 2, 4 –дихлорфенол является разобщителем окислительного фосфорилирования, так как ….

1. является слабой кислотой

2. легко окисляется и восстанавливается

3. легко диффундирует по липидному бислою мембраны

4. образует прочный комплекс с цитохромоксидазой

5. блокирует перенос электронов от дыхательного комплекса I к дыхательному комплексу II

3.2. … обладают разобщающим действием.

1. салицилаты

2. тиреоидные гормоны

3. ненасыщенные жирные кислоты

4. барбитураты

5. цианиды

 

Вид 4.

4.1. Движение электронов по дыхательной цепи заряжает внутреннюю мембрану митохондрий, а синтез АТФ разряжает ее, так как движение протонов через Fо-канал в матриксе митохондрий запускает фосфорилирование АДФ протонной АТФ–азой.

 

4.2. В присутствии разобщающих агентов коэффициент Р/О увеличивается, потому что разобщающие агенты ускоряют накопление протонов в межмембранном пространстве митохондрий.

 

Примеры ситуационных задач

Задача 1. Подсчитайте количество АТФ, которое теоретически может образоваться при окислении янтарной кислоты до щавелевоуксусной и изоцитрата до сукцинил-КоА при условии, что митохондрии не разобщены.

Задача 2. В эксперименте с изолированными митохондриями в качестве субстрата дыхания используется изоцитрат. Определите:

а) коэффициент Р/О;

б) коэффициент Р/О при одновременном присутствии в среде сукцината и амитала натрия;

в) как изменится коэффициент Р/О при добавлении к среде тиреоидных гормонов?

Задача 3. В прошлом предпринимались попытки использовать 2, 4-динитрофенол как средство для снижения массы тела. Высокая токсичность соединения заставила отказаться от этой идеи, хотя принимавшие его действительно теряли вес. Объясните, на чем основан эффект 2, 4- динитрофенола?

Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1.- б; 1.2.- А- а; 1.2.- Б- с; 1.3.-а; 1.4.-в;

Вид 2. 2.1.: 1-Б; 2-А; 3-В; 4-Б; 5-А; 2.2.; 1-Д; 2-Б; 3-Г; 4-А; 5-В; 2.3.: 1- В; 2- А; 3- Б; 4- Г.

Вид 3. 3.1.- 1, 3; 3.2. -1, 2, 3.

Вид 4. 4.1.- D(-, +, -). 4.2.- А (+, +, +).

⇐ Предыдущая9101112131415161718Следующая ⇒

Поделиться:

Популярное:

1. D триггеры, работающие по фронту.
2. I. Техники безопасности при подготовительных работах.
3. II. Работа со словарём. Научитесь одним движением руки открывать нужную букву в словаре.
4. А - типовые, разработанные в СоюзДорПроекте; б - из стеклофибробетона
5. Акушерство: работа с младенцами и детьми
6. Анализ деловой активности и рентабельности предприятия ООО
7. В эксперты надо взять того, кто считает, что работа займет очень много времени и обойдется очень дорого.
8. Вас облагают налогами даже после того, как вы перестаете работать
9. Внутренняя работа: маргинализация и ваш ум дзен
10. Внутренняя энергия. Количество теплоты. Работа в термодинамике
11. Вопрос 1. Какие работы относятся к работам на высоте?
12. Вопрос 31. Функции в Excel. Классификация. Работа с мастером функций.