МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА

⇐ ПредыдущаяСтр 10 из 11Следующая ⇒

Наиболее адекватные методы, обеспечивающие точную диагностику моногенных заболеваний, основаны на исследовании ДНК в районе определенных генов. Несмотря на то, что молекулярно-генетические методы, как правило, весьма сложны, трудоемки и дорогостоящи, данные, полученные в процессе ДНК-диагностики намного точнее и информативнее данных других анализов. Известно, что ДНК остается неизменной на протяжении всей жизни организма и одинакова во всех ядерных клетках, что позволяет использовать для анализа практически любые клетки организма, полученные на разных стадиях онтогенеза. Кроме того, с помощью ДНК-ана- лиза поврежденный ген можно обнаружить не только при наличии развернутой клинической картины заболевания, но и до появления симптомов, а также у здоровых гетерозиготных носителей мутации в гене.

Предметом ДНК-диагностики может быть как исследование гена с целью выяв-ления мутаций (прямой подход ДНК-диагностики), так и анализ сегрегации заболевания в определенной семье с полиморфными участками ДНК (маркерными локусами), тесно сцепленными с поврежденным геном (косвенный подход ДНК-диагности- ки). Прямая и косвенная ДНК-диагностика основана на методах, позволяющих идентифицировать небольшой, но строго определенный фрагмент ДНК человека. Обычно для этого используют блот-гибридизацию либо амплификацию с последующим анализом полученных образцов ДНК при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях или радиоавтографии (гл. 18).

Прямые методы ДНК-диагностики используются в тех случаях, когда известен ген, ответственный за возникновение наследственного заболевания и основные типы его патологических мутаций. Использование прямых методов ДНК-диагностики целесообразно для таких заболеваний как муковисцидоз (мажорная мутация delF508), фенилкетонурия (R408W), хорея Гентингтона (экспансия CTG-повторов) и ряда других.

Главное преимущество прямого метода - это высокая, практически 100%, точность диагностики и отсутствие необходимости ДНК-анализа всех членов ядерной семьи. Обнаружение мутации в соответствующем гене позволяет абсолютно точно подтвердить диагноз наследственного заболевания и определить генотип всех членов отягощенной семьи. Еще одно достоинство прямой диагностики — возможность выявления гетерозиготного носительства патологических мутаций у родителей умершего больного и его родственников, что особенно актуально для аутосомно-рецес- сивных заболеваний.

Основной недостаток прямых методов состоит в том, что для их применения требуется знание точной локализации патологического гена в геноме, его экзон-ин- тронной структуры и спектра его мутаций. Такая информация на сегодняшний день доступна далеко не для всех моногенных болезней человека.

К недостаткам прямых методов следует также отнести их неполную информативность, что связано с наличием широкого спектра патологических мутаций в одном и том же гене, обусловливающих развитие наследственного заболевания. В зависимости от объема спектра мутаций в определенном гене, эта информативность может широко варьировать. Часть семей в этом случае остается неинформативной для ди-

Таблица 19.6. Информативность прямых методов ДНК-диагностики для различных заболеваний

Заболевание	Информативность прямой диагностики
Ахондроплазия	100%
Хорея Гентингтона	100%
Спинальная амиотрофия	98%
Невральная амиотрофия Шарко— Мари—Тута	97%
Атаксия Фридрейха	93%
Фенилкетонурия	80%
Адреногенитальный синдром	78%
Муковисцидоз	72%
Миодистрофия Дюшенна/Бекера	60%
Болезнь Вильсона—Коновалова	45%

агностики. Табл. 19.6 дает представление об информативности прямых методов для различных заболеваний.

Косвенные методы ДНК-диагностики применяют в том случае, если ген, повреждение в котором приводит к заболеванию, не идентифицирован, а лишь локализован на определенной хромосоме, или когда методы прямой ДНК-диагностики не дают результата, (например, при значительной протяженности и сложной молекулярной организации гена, а также широком спектре патологических мутаций в нем). Косвенные методы ДНК-диагностики основаны на анализе сегрегации в семье аллелей полиморфных маркеров, находящихся в том же хромосомном регионе или тесно сцепленных с локусом заболевания. Полиморфные маркеры, используемые для косвенной ДНК-диагностики, представляют собой точковые замены, делеции/инсерции,

повторы, полиморфизм которых обусловлен различным количеством элементов в блоке.

Наиболее удобными для косвенной ДНК-диагностики признаны микросателлит- ные (мономер до 5 п.н.) и минисателлитные (мономер повтора состоит из 5-60 п.н.) полиморфные маркеры, широко распространенные в геноме человека. Для абсолют-ного большинства известных в настоящее время полиморфных сайтов такого типа был строго показан менделевский характер наследования. Наиболее типичными среди микросателлитов являются динуклеотидные повторы, а самым распростра-ненным из них — «СА»-повтор. Показано, что кластеры «СА»-повторов встречаются в геноме в среднем каждые 30 тысяч нуклеотидных пар. Во многих кластерах присутствует от 10 до 30 динуклеотидных повторов и типичное количество аллелей составляет 4-8, что обеспечивает высокую информативность маркера.

Для количественной оценки информативности данного маркера введена величи-на, получившая название информационного содержания полиморфизма (PIC — от англ. polimorphism information content), которая вычисляется по следующей формуле:

Эта величина определяет вероятность того, что изучение генотипа ребенка из ис-следуемой семьи и его родителей с помощью полиморфного маркера позволит опре-делить: с каким из аллелей в данной семье сцеплено повреждение.

Ценность полиморфного маркера для ДН К-диагностики зависит не только от его информативности, но и генетического расстояния между маркером и повреждением в гене, так как точность оценки генетического риска в значительной степени опре-деляется частотой рекомбинации между сайтом повреждения и полиморфным локу-сом.

Применение косвенных методов молекулярной диагностики предусматривает также в качестве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анализируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носителей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и неравновесия по сцеплению между маркерными сайтами и мутантными аллелями гена.

Таким образом, основной недостаток косвенных методов заключается в их не 100%-ной точности. Действительно, возможная ошибка обусловлена вероятными рекомбинациями между изучаемым полиморфным локусом и повреждением в гене, а величина этой ошибки определяется двумя факторами: генетическим расстоянием между полиморфным локусом и мутацией, приводящей к заболеванию, и генетиче-ским размером самого гена. Очевидно, что для уменьшения ошибки необходимо ис-пользовать маркеры расположенные непосредственно вблизи гена или даже внутри него. Однако, часто размер критической области локализации гена составляет не-сколько сантиморганид, кроме того существуют гены, имеющие генетический размер 3—5 сантиморганид (например ген дистрофина). Для таких генов даже при ис-пользовании внутригенных маркеров величина ошибки составит 2—3% на мейоз. С возрастанием числа анализируемых мейозов ошибка будет накапливаться. Вообще, точный расчет генетического риска при проведении косвенной диагностики пред-ставляет собой довольно сложную математическую задачу. Типичная ошибка при проведении косвенной диагностики составляет 1—5%.

К недостаткам косвенной диагностики следует отнести необходимость семейного анализа и обязательную уверенность в клиническом диагнозе, так как ни подтвер-дить, ни

опровергнуть его при использовании этих методов (в отличие от прямых) невозможно. Кроме того, косвенные методы ДНК-диагностики могут быть приме-нены только для монолокусных заболеваний и неэффективны для моногенных по- лилокусных болезней. Действительно, для таких заболеваний существует несколько локусов, в которых необходимо проводить сегрегационный анализ и не ясно, какой из локусов выбрать.

Косвенные методы не требуют знания структуры гена и спектра мутаций в нем. Необходимо только иметь сведения о его локализации. В этом состоит основное пре-имущество этих методов. Кроме того, методы косвенной диагностики информативны практически для всех обратившихся семей, поскольку всегда есть возможность среди полиморфных маркеров, сцепленных с локусом заболевания, найти информативный для данной семьи.

Золотой стандарт ДНК-диагностики на сегодняшний день - комплексное ис-пользование и прямых и косвенных методов в каждом конкретном случае: подтвер-ждение результатов косвенной диагностики результатами прямой, и наоборот. Такой подход позволяет получить наиболее точный и адекватный результат.

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 6 7 8 91011 Следующая ⇒