ПОПУЛЯЦИОННО-СТАТИСТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

⇐ ПредыдущаяСтр 8 из 11Следующая ⇒

Методы, используемые для установления частот генов и генотипов в популяции, демонстрирующие характер их изменения под влиянием окружающей среды и раз различных факторов популяционной динамики, носят название популяционно-статистических.

С помощью этих методов можно:

• определить частоты генов, степень гетерозиготности и полиморфизма,

• установить, как меняются частоты генов под действием отбора,

• выявить влияние факторов популяционной динамики на частоты тех или иных

генотипов и фенотипов,

• проанализировать влияние факторов внешней среды на экспрессию генов,

• определить степень межпопуляционного генетического разнообразия и вычислить генетическое расстояние между популяциями.

Так же методы популяционно-статистического анализа могут быть использованы для определения и подтверждения типов наследования заболевания, являясь основой применения математической статистики в клинико-генетическом анализе.

Популяционно-генетические исследования включают следующие этапы:

1) подбор популяции с учетом демографических характеристик,

2) сбор материала,

3) выбор метода статистического анализа.

Генетическое изучение популяций человека предполагает знание их демографических характеристик (размер популяций, рождаемость, смертность, возрастная структура, национальный состав), а также географических и климатических условий жизни, религиозных убеждений и т.д. Это связано с некоторыми особенностями популяций человека, которые могут быть панмиксными (случайные браки) и инбред- ными (высокая частота кровнородственных браков). В популяциях человека формирование субпопуляций связано с такими формами изоляции, которые свойственны только человеку, например расовая, социальная (социальное положение, экономические, этнические, языковые, административные), конфессиональная и идеологическая. Все это необходимо учитывать при интерпретации полученных при погтуля- ционно-генетических исследованиях результатов. Во избежание получения недостоверных результатов, выбираемая для изучения популяция также не должна быть очень большой или очень малой. Чем больше по размеру популяция (но не до бесконечности), тем выше уровень ее разнообразия и тем сложнее ее генетическая структура, а также ближе соответствие между реально наблюдаемыми и ожидаемыми генными частотами. Так для генетических исследований оптимальным считается размер популяции с численностью от 0, 5—5, 0 млн. человек.

В настоящее время для сбора материала при проведении популяционно-генетического исследования используется обзорный метод и его различные модификации, т.е. можно исследовать всю наследственную патологию, или отдельную группу заболеваний, или только одно заболевание, но изучая все население выбранного региона.

Наследственные заболевания распределены по различным регионам земного шара, среди разных рас и народностей неравномерно, а знания о распределении частот заболеваний и количестве гетерозигот в регионе способствуют правильной организации профилактических мероприятий. Если известна частота заболевания в популяции, и при допущении, что эта популяция находится в генетическом равновесии по данному признаку, для расчета частот генотипов и фенотипов наиболее широко применяется формула Харди-Вайнберга. Для диаллельной системы — она имеет вид р² + 2pq + q² = (p + q)²= 1, для трехаллельной - (а + Ь + с)² = 1). (Подробнее о законе Харди-Вайнберга и условиях его выполнения см. гл. 17). Например, частота ФКУ в популяции составляет 1: 10000, т.е. q² = 0, 0001, значит q = 0, 01. По закону Харди-Вайнберга р + q = 1, отсюда р= 1 — q = 1-0, 01 = 0, 99, а 2pq = 2 х 0, 99 х 0, 01 = 0, 0198. Таким образом, частота гетерозигот по гену ФКУ в изучаемой популяции составляет приблизительно 2%.

На практике при расчете частоты гетерозигот иногда принимают приближенное значение р (р = 1) и, соответственно, 2pq = 2q. Рассмотрим следующий пример. Частота му- ковисццдоза 1: 2500, значит q² = 0, 0004, q = 0, 02. По определению р + q = 1, отсюда р = 1 - < 7 = 1 - 0, 02 = 0, 98, a 2pq=2q = 2 * 0, 02 = 0, 04. Таким образом, частота гетерозигот по гену муковисцидоза в изучаемой популяции составляет приблизительно 4%.

Для установления и подтверждения типа наследования заболеваний необходимо проверить соответствие сегрегации (расщепления) по исследуемому признаку в отягощенных семьях данной популяции менделевским закономерностям. При правильном сборе материала соотношение больных и здоровых сибсов одного и того же поколения и сегрегационная частота (частота с которой ген сегрегирует в исследуемых семьях) будут соответствовать определенному типу наследования. Методом х-квадрат подтверждается соответствие количества больных и здоровых сибсов для ауто- сомно-доминантной патологии в семьях с полной регистрацией (через больных родителей):

где О - ожидаемое, Н — наблюдаемое количество больных или здоровых сибсов в выявленных семьях.

Для расчета сегрегационной частоты (р) можно использовать ряд методов: метод сибсов Вайнберга, пробандовый метод.

Методы сибсов Вайнберга и пробандовый используются в случае регистрации се-мей через больных детей: при рецессивной патологии (родители здоровы) и при ау- тосомно-доминантных заболеваниях в случае неполной регистрации.

Метод сибсов Вайнберга может применяться только при исследовании всей попу-ляции или случайной выборки, в которой каждый больной имеет одинаковую веро-ятность попасть в нее и все больные имеют равные шансы стать пробандом, иными словами все пораженные должны являться пробандами. Сущность этого метода со-стоит в подсчете отношения суммарного количества больных сибсов к общему коли-честву их здоровых братьев и сестер, соответственно: ), где г — число больных в семье, s — число детей в семье.

При использовании этого метода существует вероятность получения искаженных результатов, что обусловлено следующими причинами: малое количество детей в семьях, попавших в выборку; неполная пенетрантность или скрытое носительство мутантного гена; наличие стертых форм и разных стадий болезни; пропуск семей в случае рождения здорового ребенка от гетерозиготных родителей.

Пробандовый метод применяется в практике популяционно-генетических иссле-дований гораздо чаще. Он используется при изучении клинического материала слу-чайно попавшего под наблюдение, т.е. если не все пораженные сибсы были зареги-стрированы в качестве пробандов.

Так как на практике в поле зрения исследователя попадают семьи, в которых хотя бы один ребенок болен, для восстановления истинного соотношения при учете сибсов Вайнберг предложил исключать пробанда. В результате формула расчета сег-регационной частоты имеет вид:

где а — число пробандов, г — число больных, s - число детей в данной семье.

К тому же, при помощи пробандового метода можно оценить полноту выявления семей сданной патологией или вероятность регистрации:

При современных популяционных исследованиях используются более сложные, модифицированные и компьютеризованные методы расчетов (методы взвешенных шансов и линейной интерполяции), но основанные на тех же принципах.

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД

Анализ кариотипа человека проводят в культуре делящихся соматических и половых клеток. Наиболее часто при цитогенетических исследованиях в медицинской генетике используют культуру клеток периферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов. Наиболее доступны для исследований лимфоциты периферической крови, которые, в большинстве случаев и служат объектом цитогенетического анализа у человека в постнатальном периоде. Для анализа кариотипа плода могут быть использованы различные клеточные культуры; их выбор диктуется сроком беременности, в котором проводится исследование. Так, на раннем сроке (до 12 недель внутриутробного развития) анализ хромосом целесообразно проводить в клетках ворсин хориона, в то время как в более позднем сроке цитогенетическому исследованию подвергают клетки плода, выделенные из амниотической жидкости, пуповинной крови и плаценты (гл. 25).

Для исследования кариотипа человека достаточно получить образец периферической крови в количестве 1—2 мл. Цитогенетический анализ включает три основных этапа: 1) культивирование клеток; 2) окраску препарата; 3) микроскопический анализ препарата. Культивирование клеток проводится следующим образом. После забора образец крови помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений — фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток. Успех цитогенетического исследования в значительной мере определяется тем, сколько клеток в культуре будут находиться в стадии мегафазы. Для увеличения количества метафазных клеток за полтора часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин, который разрушает клеточное веретено, приостанавливает деление клеток на стадии мегафазы и увеличивает конденсацию хромосом. Обычно, продолжительность культивирования составляет 72 ч. После его окончания клетки с питательной средой центрифугируют и помещают в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. Гипотоническая обработка приводит к разрыву ядерной оболочки и межхромосомных связей и сво-бодному перемещению хромосом в цитоплазме. После этого производится фиксация клеток смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3: 1, после чего кле-точную суспензию раскапывают на охлажденные влажные предметные стекла и вы-сушивают на воздухе.

На следующем этапе цитогенетического исследования производится окраска препаратов. В зависимости от целей исследования, то есть от того, какой именно тип перестроек необходимо выявить, можно использовать различные виды окрашивания.

Наиболее простой метод окрашивания хромосом, называемый в настоящее время сплошным или рутинным, применяют для определения количества хромосом в препарате и выявления геномных мутаций и анеуплоидий. При этой окраске ис-пользуют краситель Гимзы, который равномерно прокрашивает хромосомы по всей длине, что дает возможность идентифицировать хромосомы и оценить их количество в препарате. Этот метод окраски успешно применялся до 70-х годов прошлого века и позволил выявить этиологию большинства хромосомных синдромов, характе-ризующихся изменением количества хромосом. В настоящее время сплошное окра шивание применяют, в основном, для выявления количественных аномалий кариотипа, а также специфического сайта ломкости при синдроме фрагильной X- хромосомы. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по всей длине, представлен на рис. 19.6, а.

Однако использование рутинного метода окраски не позволяет выявлять структурные перестройки хромосом. В этих случаях применяют специальные методы, так называемой, дифференциальной окраски, в результате которой хро-мосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и толщина темных и светлых полос строго индивидуальны для каждой хромосомы, что позволяет проводить их точную идентификацию и выявлять структурные перестройки. Для объяснения возникновения различно окрашенных полос на хромосомах выдвигается несколько гипотез: различия в количественном содержании А—Т- и G—С-пар оснований, особенности строения нуклеосом, а также асинхронность репликации различных участков ДНК.

Наибольшее распространение получил простой и эффективный G-метод диффе-ренциального окрашивания. В этом случае для окрашивания хромосом также используют краситель Гимзы, однако, хромосомы предварительно обрабатывают раствором трипсина. Процедура окрашивания занимает от 5 до 10 минут и приводит к появлению специфичного для каждой хромосомы рисунка поперечной исчерченности. Показано. что количество полос в метафазных и прометафазных пластинках существенно различается: в метафазных пластинках их число достигает 400, а в прометафазных — от 800 до 1000. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по G- методу, представлен на рис. 19.6, б.

Другие методы окраски используются реже вследствие их сложности или узкой специфичности. R-метод обусловливает сегментацию хромосом, противоположную той, которая имеет место при окраске G-методом.

С-метод дифференциальной окраски позволяет анализировать лишь некоторые районы хромосом — участки так называемого конститутивного гетерохроматина, локализованного в околоцентромерных областях длинных плеч хромосом 1, 9 и 16, в длинном плече Y-хромосомы, а также в коротких плечах акроцентрических хромо-сом.

Для дифференциальной окраски хромосом могут использоваться флуорохромы: акрихин, акрихин-иприт, квинакрин и другие (Q-метод окраски). По результатам дифференциальной флуоресцентной окраски идентифицируют каждую пару гомо-логов, а по свечению Y-хроматина определяют наличие Y-хромосомы в интерфазном

ядре.

Третий этап исследования кариотипа человека заключается в световом микро- скопировании фиксированных и окрашенных препаратов метафазных хромосом. Для адекватного выявления хромосомных аномалий необходимо проанализировать не менее 30 метафазных пластинок. В том случае, если предполагается мозаицизм по хромосомным аномалиям, количество анализируемых хромосом должно быть увеличено. Число клеток (п) необходимых для анализа с целью определения задан-ного уровня мозаицизма можно определить по формуле биноминального распределения: Р = (1 — р)п, где р — заданный уровень мозаицизма, Р — вероятность обнаружения мозаицизма. Учитывая, что в различных клетках организма количест-во нормальных и аномальных клонов может различаться, для выявления мозаицизма может потребоваться анализ нескольких тканей, например, клеток крови, фиб- робластов, половых желез.

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД

В ряде случаев использование традиционного цитогенетического метода не позволя-ет идентифицировать все имеющиеся хромосомные перестройки, особенно если в них вовлечены более двух хромосом или они захватывают очень малый по размеру участок. Для этих целей в последние годы разработаны новые высокоинформатив-ные молекулярно-цитогенетические методы, главный из которых флуоресцентная гибридизация in situ, или так называемый FISH-метод (от англ. fluorescent in situ hybridization). С помощью этого метода можно проводить гибридизацию метафазных или интерфазных хромосом с различными ДНК-зондами, меченными флуоресцирующими веществами (гл. 18). Зонды представляют собой клонированные последовательности или выделенные участки ДНК. Наиболее часто используют высокоповторяющиеся последовательности ДНК центромерных или перицетромерных районов, однако, в ряде случаев возникает необходимость в применении уникальных ДНК- последовательностей, таких как космидные клоны или анонимные последовательности. С их помощью удается не только идентифицировать различные типы структурных хромосомных перестроек, но и провести более тонкий генетический анализ (например, идентифицировать точки разрыва при транслокациях, инверсиях, делениях, а также структуру маркерных хромосом).

В некоторых случаях, особенно при возникновении сложных транслокаций с во-влечением нескольких хромосом, возникает необходимость использовать в процессе гибридизации большое число флуоресцирующих ДНК-зондов, которые иногда прокрашивают хромосому практически целиком. Такую модификацию FISH-метода называют супрессорной гибридизацией. Для успешного осуществления этих методов созданы специальные библиотеки хромосомоспецифичных участков ДНК. В пос-ледние годы при проведении FISH-анализа все чаще используют ДНК-зонды, ме-ченные различными цветами. Применение разноцветных зондов позволяет более быстро и эффективно провести анализ количественных и структурных перестроек хромосом, особенно, в случае пренатальной экспресс-диагностики.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ НОРМАЛЬНОГО КАРИОТИПА ЧЕЛОВЕКА

Для описания нормального кариотипа человека, а также для обозначения структур-ных и количественных перестроек хромосом используется определенная универ-сальная схема и специальные символы. Описание кариотипа начинают с указания общего количества хромосом в клетке, после чего ставится запятая и обозначается набор половых хромосом, указывающий на пол обследованного. Например, запись 46, XX характеризует нормальный кариотип женщины, а 46, XY — нормальный кари-отип мужчины. Если хромосомных перестроек у обследованного не выявлено, то за-пись на этом заканчивается. В ряде случаев, при обследовании обнаруживают, так называемый, нормальный полиморфизм хромосом - индивидуальные особенности их строения. Полиморфизм наиболее характерен для акроцентрических хромосом и, как правило, отражает вариабельность размеров гетерохроматиновых сегментов, наличие спутников и спутничных нитей в области коротких плеч и их величину (рис. 19.7). Иногда в качестве вариантов нормального кариотипа рассматривают наличие ломких сайтов хромосом, часто выявляемых при культивировании в определенной среде. В большинстве случаев наличие полиморфизма строения хромосом не приво-дит к возникновению патологических симптомов у их обладателя. Отсутствие пато-логических последствий при увеличении размеров гетерохроматиновых блоков хро-мосом можно объяснить особенностью строения гетерохроматина. Показано, что в его структуру входит ДНК с многократно повторяющимися последовательностями, количественные изменения которой не приводят к существенному генному дисба-лансу. Кроме того, считается, что некодирующая саттелитная ДНК гетерохромати-новых районов некоторых хромосом может способствовать повышению уровня функционирования генома.

Необходимо отметить, что иногда наличие нормального полиморфизма хромосом, все-таки увеличивает риск рождения ребенка с хромосомными аномалиями.

Существуют данные, свидетельствующие о том, что среди супружеских пар, у которых наблюдалось рождение детей с пороками развития, а также страдающих бесплодием и привычным невынашиванием беременности, статистически значимо чаще выявляется носительство хромосом с крупными гетерохроматиновыми блоками. Преобладание лиц с увеличенными в размере гетерохроматиновыми сегментами в акроцентрических хромосомах, а также хромосомах 1, 9 и 16, отмечено в группе детей с множественными врожденными пороками развития невыясненной этиологии и олигофренией.

Обозначения основных вариантов полиморфизма нормального кариотипа человека представлены в табл. 19.2.

Достаточно часто в популяции здоровых людей при цитогенетическом анализе выявляется заметное увеличение коротких плеч некоторых хромосом (например, хромосомы 15). Изучение нормального полиморфизма хромосом может иметь значение для определения родительского происхождения хромосомной перестройки. Если установлено, от кого из родителей унаследован полиморфизм хромосом, то это указывается при записи кариотипа. Например, запись 46, XX, 15ps+pat означает, что женщиной от отца унаследованы увеличенные спутники на хромосоме 15, а запись 46, XY, 16 qh+ mat указывает на материнское наследование увеличенного в размере гетерохроматина хромосомы 16.

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 6 789 10 11 Следующая ⇒