БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

⇐ ПредыдущаяСтр 9 из 11Следующая ⇒

Характерные изменения биохимических показателей, выявляемые при той или иной наследственной патологии, служат постоянным, а иногда и единственным призна-ком заболевания. Кроме того, отклонения в биохимических параметрах, как прави-ло, предшествуют возникновению клинических симптомов, и существенно не зависят от клинико-генетического полиморфизма, обусловливающего вариабельность заболевания по степени тяжести и времени начала манифестации. Таким образом, биохимические параметры можно считать наиболее информативным описанием фенотипа. Подтверждением этого являются биохимические показатели гетерозигот, значения которых часто занимают промежуточное положение между значениями у нормаль-ных и патологических гомозигот: например, гетерозиготные носители рецессивного аллеля фенилкетонурии симптомов заболевания не имеют, но реагируют на введение фенилаланина более сильным повышением концентрации этой аминокислоты в плазме, чем нормальные гомозиготы. К тому же не для всех наследственных заболеваний обнаружен молекулярно-генетический дефект или имеются возможности для его выявления. В связи с этим, биохимические методы играют важнейшую роль в диагностике наследственных заболеваний, позволяя подтверждать диагноз в случае атипичной клинической картины, проводить доклиническую диагностику и начинать лечение на ранних стадиях заболевания, выявлять гетерозиготных носителей, дифференцировать генетически различные формы болезни со сходной клинической картиной. Результаты диагностики гетерозиготного носительства биохимическими методами могут быть использованы в практике медико-генетического консультирования при расчетах риска рождения ребенка с наследственным заболеванием на основе вероятностных подходов.

Предметом биохимической диагностики могут быть различные классы органиче-ских и неорганических веществ (аминокислоты, углеводы, липиды, мукополисаха- риды, ионы металлов и др.) и их метаболиты, концентрация и отклонения в актив-ности ферментов. Универсальность биохимической диагностики состоит в том, что исследовать этими методами можно любую ткань или секрет организма (мочу, пот, кровь, слюну, мышцы и др.). Это обусловливает многообразие биохимических мето-дов и необходимость их непрерывного совершенствования.

Безусловно, биохимические методы играют первоочередную роль в диагностике наследственных нарушений обмена веществ (ИБО). Универсальность этих методов позволяет использовать их в дифференциальной диагностике и для выявления гете-розиготного носительства другой моногенной патологии, при которой изменение биохимических показателей является вторичным: например, при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера (ПМДД/Б) повышается уровень креатин- фосфокиназы (фермент мышц) в крови больных при начальной и развернутой стадии заболевания, а также и у 30% носительниц гена ПМДД/Б.

Для диагностики ряда состояний используют комбинированные биохимические методы. Так иммуно-генетическое тестирование позволяет поставить или уточнить диагноз при врожденных иммунодефицитных состояниях, при подозрении на анти-генную несовместимость матери и плода по тем или иным системам групп крови. Иммуно-гистохимический метод используется для выявления той или иной белковой субстанции в какой-либо ткани при помоши специфичных антител (именно так проводят дифференциальную диагностику поясно-конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий и ПМДД/Б: исследуют мышечные волокна на наличие или отсутствие в них дистрофина при помощи антител, специфичных для С-домена, Rod-домена и N-конца белка дистрофина).

С каждым годом совершенствуясь, биохимические методы становятся все более сложными, многоступенчатыми, а, следовательно, и дорогими. Использовать их для программ массового скрининга наследственных болезней, многие из которых встречаются в популяциях с сравнительно низкой частотой, невыгодно. Необходимо предварительное «просеивание» популяции (гл. 25).

Биохимические методы подразделяют на качественные, количественные и полу- количественные.

Качественные реакции позволяют обнаружить избыточные концентрации суб-стратов блокированной ферментной реакции или их производных, накапливающих-ся при НБО. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, отличаются низкой себестоимостью и не дают ложноотрицательных результатов, а информация, полученная с их помощью, позволяет с высокой долей вероятности заподозрить НБО у пациента. Однако на результаты этих тестов влияет применение ряда лекар-ственных препаратов и их метаболитов, а также некоторых пищевых добавок. Каче-ственные пробы бывают: универсальными (выделяется группа заболеваний, класс веществ; например, ЦПХ-тестдля мукополисахаридов) и специфическими (на цис- тин-гомоцистин, метилмалоновую кислоту и др.). Наиболее распространены качест-венные тесты с мочой, вследствие доступности и простоты получения материала для исследования. Основные используемые для диагностики НБО качественные тесты с мочой представлены в табл. 19.3.

Полуколичественные и количественные тесты проводятся как с мочой (тест с циа-нид- нитропруссидом - гомоцистинурия, цистинурия; ЦПХ-тест- мукополисахари- дозы), так и с кровью (газы крови, глюкоза, ионы аммония, молочная кислота, кето-новые тела, пировиноградная кислота, холестерин, триглицериды) и могут иметь различную степень сложности. Наиболее простые из них, такие как измерение кон-центрации лактата, пирувата, кетоновых тел, ионов аммония, а также определение кислотно-щелочного равновесия, позволяют планировать дальнейшую тактику диагностики: так метаболический ацидоз служит показанием для проведения газовой хроматографии (ХМС) с целью исключения органических ацидурий, а повышение концентрации ионов аммония - для исключения дефектов цикла мочевины; определение концентрации кетоновых тел и соотношения концентраций лактат/пируват в крови является первым этапом для дифференциальной диагностики митохондриальных болезней.

Конечно, решающее значение в диагностике нарушений обмена играют более сложные и высокоточные количественные методы, такие как флуориметрические, хроматомасс-спектрометрия, спектрофотометрия, различные виды хроматографии и электрофорез гликозаминогликанов (ГАГ). Все эти методы можно условно разде-лить на две группы: методы позволяющие получить спектр какого-либо класса ве-ществ, например аминокислот, и методы для определения концентрации конкретно-го вещества, например фенилаланина или тирозина (флуориметрический метод). Хроматографические методы, как правило, дают информацию о спектре и количест-ве веществ (табл. 19.4).

Тонкослойная, колоночная и др. виды хроматографии применяются для выделе-ния и очистки анализируемых соединений, а также для получения результатов на по- луколичественном уровне. Так, тонкослойную хроматографию используют для выявления дефектов обмена пуринов и пиримидинов, углеводов, аминокислот, олигосахаридов и гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Метод не требует специального дорогостоящего оборудования, интерпретация результатов довольно проста, а стоимость одного анализа невысока, что иногда позволяет использовать этот метод и на первом этапе скрининга (гл. 25). Более того, поскольку тонкослойная хромато графия в зависимости от класса используемой аппаратуры может быть качественной, полуколичественной и количественной, она может применяться на разных этапах скрининга.

Наиболее точным, но сложным и обладающим малой пропускной способностью (2 анализа в сутки) методом является ионообменная жидкостная хроматография с использованием аминокислотного анализатора.

Метод высоковольтного электрофореза с последующей нисходящей хроматогра-фией аминокислот на бумаге дает ту же информацию, но отличается высокой пропу-скной способностью (30-40 проб в сутки), дешевле, чем ТСХ, но менее чувствителен.

В последние годы все большее значение приобретают высокоэффективная жид-костная хроматография (ВЭЖХ) и хроматомасс-спектрометрия (ХМС).

ХМС - комбинированный метод хроматографии и масс-спектрометрии. Он поз-воляет получать как количественную, так и качественную информацию, например, определять какие вещества, с какой молекулярной массой, присутствуют в анализи-руемой пробе и в каком количестве. Кроме того, с помощью ХМС можно получить количественную информацию о неразделенных или совместно элюируемых соеди-нениях, что является одним из важных преимуществ этого метода.

Тандемная масс-спектрометрия (ТМС) — метод, с помощью которого можно ко-личественно оценить 3000 метаболических маркеров разных групп НБО одновре-менно и охарактеризовать классы веществ и их молекулярную массу. При этом вре-мени для подготовки проб и проведения анализа затрачивается существенно мень-ше, чем при использовании некоторых выше перечисленных методов, например, при ГХ.

Таким образом, совершенствование методов биохимической диагностики позво-ляет выявлять и подтверждать все большее количество нарушений обмена веществ. Классы НБО, диагностируемые с применением различных биохимических методов анализа, представлены в табл. 19.5.

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 6 7 8910 11 Следующая ⇒