Метод Гольджи—Кокса (для животных)

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 5Следующая ⇒

1. Животное анестезируют нембуталом (эфир применять нельзя) в летальных дозах, затем берут кусочки головного мозга, быстро ополаскивают в теплом изотоническом растворе хлорида натрия и помещают в 50 мл следующей смеси: 20 мл 5 % раствора бихромата калия, 20 мл 5 % раствора сулемы, 40 мл дистиллированной воды. К этой смеси при постоянном помешивании добавляют 8 мл 5 % раствора бихромата калия. Кусочки в этом растворе помещают на стеклянную вату. Банки хранят в темном месте при комнатной температуре (не перемешивая) в течение 8 нед. Для коры головного мозга кошки, котенка и крысы этот срок меньше.

2. Кусочки без промывания ополаскивают в смеси равных количеств ацетона и 100 % спирта, затем помещают в такую же смесь на 24 ч в закрытой посуде.

3. Переносят в смесь равных количеств 100 % спирта и эфира на 4 ч.

4. Помещают в 5 % целлоидин на 24 ч, затем в 12 % целлоидин на 12 ч. Заливают на блоки и укрепляют хлороформом.

5. Срезы толщиной 100 — 120 мкм режут на микротоме в 70 % спирт.

6. Доводят до дистиллированной воды.

7. Осуществляют редукцию в 5 % растворе сульфата калия (к большому объему раствора добавляют несколько капель 5 % раствора щавелевой кислоты) для просветления фона и его обесцвечивания.

8. Промывают в дистиллированной воде в течение 5 мин. Проводят в смеси равных количеств спирта и хлороформа и наклеивают на предметное стекло 1 % раствором целлоидина.

9. Стекла со срезами проводят через смесь равных количеств абсолютного спирта и хлороформа.

10. Просветляют в скипидаре и заливают в бальзам.

==========================================================

Метод Глисса в модификации Владимировой

1. Небольшой кусочек ткани головного мозга погружают в жидкость Бодиана (5 мл формалина, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 90 мл 80 % спирта) на 3 — 4 дня.

2. Промывают в проточной воде в течение 24 ч.

3. Срезы толщиной 12 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме, ополаскивают в дистиллированной воде и помещают на 24 ч в 50 % спирт, добавив в него 10 капель крепкого аммиака.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде и помещают в 10 % раствор нитрата серебра на срок от нескольких часов до 5 дней (пока срез не станет коричневым).

5. Не ополаскивая, переносят в 10 % формалин, меняя его несколько раз, пока не исчезнет муть.

6. Ополаскивают в проточной воде.

7. Погружают на 30 с (можно до 1 мин) в смесь, состоящую из 10 мл 100 % спирта и 10 мл 20 % раствора нитрата серебра (выпадающий осадок растворяют аммиаком, прибавляя его по каплям).

8. Переносят в 10 % формалин, меняя несколько раз до исчезновения мути.

9. Промывают в дистиллированной воде и помещают в 1 % раствор хлорного золота до появления стального цвета.

10. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия.

11. Промывают в дистиллированной воде.

12. Переносят на предметное стекло, подсушивают на воздухе, затем проводят через ацетон, ксилол, заключают в бальзам.

Результат: на сером фоне видны темные нервные клетки, ядра, нейрофибриллы в нервных клетках и синаптических волокнах, синаптические окончания.

==========================================================

Методы Бильшовского

Предварительной обработкой материала для выявления нейрофибрилл, по Бильшовскому, служит фиксация нейтральным формалином. Оптимальная ее продолжительность — 3 — 6 нед после помещения в формалин, однако материал, лежавший в формалине несколько лет, также дает удовлетворительные результаты, особенно после обработки пиридином. Проводят окраску срезов (импрегнация срезов) или кусочков (тотальная импрегнация). Для получения хороших результатов необходимы точное соблюдение прописей (инструменты только стеклянные! ) и применение чистых реактивов.

Импрегнация срезов

Материал фиксируют в растворе формалина (1: 9) не менее 14 дней (максимальная толщина кусочков 1 см); промывают в проточной воде 2 —3 ч, затем в дистиллированной воде 1—2 дня; нарезают на замораживающем микротоме срезы толщиной.5 — 10 мкм и собирают в дистиллированную воду. Хорошие срезы вылавливают и промывают 1 — 2 раза в дистиллированной воде, которую меняют 3 — 4 раза.

Импрегнация:

1) срезы помещают в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч;

2) быстро (2 — 3 с) проводят через дистиллированную воду, сменяя стеклянные палочки;

3) помещают в свежеприготовленный раствор аммиачного серебра: к 10 мл 10 % раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40 % раствора гидроксида натрия — образуется коричнево-черный осадок окиси серебра. После этого при постоянном взбалтывании к раствору серебра по каплям добавляют раствор аммиака (молекулярная масса 0, 875 — 0, 910) до тех пор, пока от растворяющегося осадка останется лишь несколько крупинок. После каждой капли выжидают 10 — 20 с, прежде чем добавить следующую каплю. Необходимо избегать избытка аммиака. Раствор разводят до 20 мл дистиллированной водой. В раствор аммиачного серебра срезы помещают на 10 — 20 мин, в нем они должны приобрести желтоватый оттенок;

4) быстро проводят через 2 — 3 порции дистиллированной воды;

5) восстанавливают в растворе формалина (1: 4), не содержащем кислоты в течение 10 мин, — срезы быстро окрашиваются в темно-серый цвет;

6) промывают в воде 15 мин;

7) золотят в разбавленном растворе трихлорида золота (3 — 5 капель 1 % раствора желтого трихлорида золота на 10 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока коричневый тон не перейдет в серый или серо-фиолетовый;

8) фиксируют 1—2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия;

9) тщательно промывают в обычной воде (1—2 ч); проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол (не дольше, чем нужно) и заключают в бальзам.

На хорошо импрегнированных препаратах нейрофибриллы и перицеллюлярные сетчатые структуры ганглиозных клеток черного цвета выделяются на светлом фоне, так же отчетливо видны тончайшие осевые цилиндры.

К восстанавливающему 4 % раствору формалина можно добавить 1 % цитрат натрия в соотношении 1: 9. В этом случае картина, получающаяся в результате серебрения, очень равномерная и более контрастная.

==========================================================

Метод серебрения с предварительной обработкой пиридином

В тех случаях, когда материал предназначается главным образом для выявления осевых цилиндров, а не внутриклеточных нейрофибрилл, М. Бильшовский рекомендует предварительно обработать его пиридином (благодаря этому сильно подавляется подкраска глии и соединительной ткани). Фиксацию и предварительную подготовку материала проводят по методу Бильшовского. Замороженные срезы промывают в дистиллированной воде 1 — 2 ч и переносят в неразведенный пиридин на 24— 48 ч. Затем срезы тщательно освобождают от пиридина, промывая их в часто сменяемой дистиллированной воде до тех пор, пока не исчезнет специфический запах пиридина. После этого переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч и далее обрабатывают по методу Бильшовского.

Тотальная импрегнация

Импрегнацию целого кусочка проводят с предварительной обработкой пиридином или без нее. В последнем случае кусочки ткани размером не более 1 см3 фиксируют в формалине и без промывания переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 1 — 8 дней (в зависимости от величины). Затем перекладывают на 0, 5 — 6 ч в раствор аммиачного серебра, быстро проводят через дистиллированную воду и помещают в 20 % раствор формалина на 12 —24 ч. После этого материал как можно быстрее заливают в парафин.

Более надежной является тотальная импрегнация с пиридином по Билшовскому.

1. Органы, фиксированные не менее 1 нед в нейтральном формалине (от 1: 4 до 1: 9), разрезают на кусочки толщиной не более 0, 5 см и на 3 — 4 дня помещают в чистый неразведенный пиридин при комнатной температуре.

2. Промывают 12 — 24 ч в проточной воде и столько же в часто сменяемой дистиллированной воде.

3. Пропитывают в 3 % растворе нитрата серебра при 36 °С 3 — 5 дней.

4. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.

5. Помещают на 24 ч в раствор аммиачного серебра (готовят так же, как для импрегнации срезов, но доливают дистиллированной водой до 100 мл).

6. Промывают в часто сменяемой воде (по Билшовскому до 1 ч в зависимости от толщины блока, по Буке, 2 ч).

7. Восстанавливают в нейтральном формалине (1: 9) 10 — 12 ч.

8. Ополаскивают в дистиллированной воде, быстро проводят через спирты, заливают в парафин; золочение и фиксацию проводят на срезах.

При тотальной импрегнации с применением пиридина можно использовать материал, находившийся в формалине в течение нескольких лет. При этом методе глия и соединительная ткань обычно отступают на задний план или выделяются благодаря иному тону окраски. Фибриллярные структуры ганглиозных клеток выявляются менее четко, чем при использовании оригинального метода, моторные и чувствительные концевые образования нервов, наоборот, видны отчетливо.

Нередко импрегнация протекает хорошо не во всем кусочке, а лишь в его определенных зонах. Более благоприятные результаты наблюдаются в эмбриональных тканях, которые легче пропитываются.

М. Бильшовский рекомендует использовать для восстановления серебра не формалин, а смесь, состоящую из 75 мл 30 % раствора фруктозы, 75 мл 10 % раствора сегнетовой соли, 20 мл 10 % раствора карбоната калия и 5 мл чистого формалина. Импрегнированные блоки помещают в эту смесь на 24 ч при 50 °С. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, обезвоживание и заливка.

Смесь может быть применена и для восстановления импрегнированных срезов. В этом случае срезы после пропитывания в растворе аммиачного серебра быстро ополаскивают и переносят на 1 — 2 мин в указанный раствор, подогретый до 50 °С. Затем следуют промывание, золочение и т.п.

С помощью восстанавливающей смеси по Бильшовскому особенно хорошо выявляются перицеллюлярные концевые образования в ЦНС.

==========================================================

Метод Адэра и Витгилию

(для выявления нейрофибрилл и синапсов)

Головной мозг кошки фиксируют в дважды сменяемом ацетоне по 24 ч в каждом. Заливают в парафин в течение 18 — 24 ч. Срезы толщиной 15—20 мкм депарафинируют, промывают в 100 % спирте и опускают на 6 ч в 1 % раствор аммиака на абсолютном спирте. Затем погружают на 6 ч в пиридин. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 12 ч при температуре 30 °С, затем промывают в 100 % спирте. Восстанавливают серебро в растворе пирогалловой кислоты с формалином (95 мл 95 % спирта, 3 г пирогалловой кислоты и 8 мл формалина).

Далее проводят через дважды сменяемый спирт, промывают несколько раз в дистиллированной воде и обрабатывают 1 % трихлоридом золота до обесцвечивания. Промывают в 6 —8 порциях дистиллированной воды.

Для усиления окраски срезы обрабатывают 3 — 4 мин в 1 % растворе щавелевой кислоты. Снова промывают в 6-8 порциях дистиллированной воды и погружают на 5—10 мин в 10 % раствор тиосульфата натрия. Далее промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилолах и заключают в бальзам.

Результат: хорошо выражены нейрофибриллы черного цвета, видны конечные колечки и колбочки.

==========================================================

Методы Рамон-и-Кахаля

Методы импрегнации нейрофибрилл, предложенные S. Ramon y Cajal, применяют преимущественно в форме тотальной импрегнации. Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном.

Недостаток методов состоит в том, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не очень хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются.

В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.

Метод I.

Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.

1. Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3 — 5 дней в 0, 75 — 3 % раствор нитрата серебра при 35 °С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.

2. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

3. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1 — 2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.

5. Заливают в целлоидин или парафин.

Обезвоживать следует по возможности быстро, около 5-6 ч.

Для обработки материала, взятого у новорожденных и эмбрионов, берут 0, 75 % раствор нитрата серебра, у взрослых млекопитающих—3 %, у беспозвоночных—6 % раствор. На 2—3 кусочка расходуют 80—100 мл раствора.

Метод II.

Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.

1. Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.

2. Разрезают на кусочки толщиной 2, 5—3 мм, импрегнируют 5—7 дней в 1—1, 5 % растворе нитрата серебра при 30—35 °С.

3. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

4. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1—2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

5. Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.

6. Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).

В том случае, если импрегнация слишком светлая, срезы 5 — 10 мин обрабатывают в смеси, состоящей из 3 г тиоцианата аммония. 3 г тиосульфата натрия, 100 мл дистиллированной воды и нескольких капель 1 % раствора трихлорида золота. Если к спирту, используемому для фиксации, добавить веронал, хлоралгидрат и т.п. (на 50 мл 1 г), то для импрегнации в растворе нитрата серебра потребуется только 5 дней. Это делает метод более надежным, и он может быть применен на материале, долгое время лежавшем в спирте.

Метод III.

Особенно показан для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика.

Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1—12 капель (для большого мозга 1—3 капли, мозжечка—4, спинного и продолговатого мозга—8—12, периферических окончаний — 2 —3) раствора аммиака (молекулярная масса 0, 910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2—4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод IV.

Пригоден для выявления безмякотных волокон ЦНС, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка.

Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6 — 12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96 % спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; далее обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод V.

Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий).

Материал фиксируют 24 ч в 70 % пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95 % спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12—24 ч; переносят на 6-12 ч в 95 % спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод VI.

Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка.

Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100 % спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100 % спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12 — 24 ч в проточной воде и 2 — 5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

⇐ Предыдущая 1 2 345 Следующая ⇒