Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


Импрегнация замороженных срезов.



Метод пригоден для исследования большого мозга, мозжечка, двигательных концевых пластинок, чувствительного эпителия.

1. Материал фиксируют в формалине (1: 4) 3 дня или дольше.

2. Замороженные срезы толщиной 30-40 мкм собирают в формалин.

3. После быстрого (несколько минут) промывания в дистиллированной воде помещают в смесь, состоящую из 12 мл 2 % раствора нитрата серебра, 7-10 капель пиридина и 5-6 мл 97 % спирта, в которой срезы за 4-6 ч должны стать светло-коричневыми; если этого не происходит, то следует в течение нескольких минут подогреть над пламенем.

4. Отдельные срезы на 2—4 с погружают в 100 % спирт.

5. Восстанавливают 1—3 мин в смеси, в состав которой входят 0, 3 г гидрохинона, 70 мл дистиллированной воды, 20 мл формалина и 15 мл ацетона.

6. Основательно промывают в воде, золотят и фиксируют как обычно.

7. Промывают, извлекают на предметное стекло, обсушивают фильтровальной бумагой.

8. Проводят через 100 % спирт, гвоздичное масло, ксилол, заключают в бальзам.

В том случае, если с помощью этого метода не удается выявить мякотные волокна белого вещества, то перед серебряной ванной замороженные срезы 2 ч обрабатывают в смеси, состоящей из 10 мл 100 % спирта, 10 мл дистиллированной воды и 8-10 капель аммиака. Затем промывают, помещают в раствор нитрата серебра с пиридином и т.д.

 

==========================================================

Метод Рамона—Лермитта

(выявление дегенерированных синапсов)

Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 — 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 — 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга — 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга — 60 мин, мозжечка и таламуса — 80 мин). После импрегнации срезы должны быть табачного цвета.

1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака).

2. Промывают в дистиллированной воде.

3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными.

4. Переносят в 0, 5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми.

5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин.

6. Промывают в дистиллированной воде (2 — 3 смены)

7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин.

8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.

 

==========================================================

Методика Бильшовского

(выявление внутриклеточных нейрофибрилл,

Осевых цилиндров нервных волокон и сенильных бляшек)

Служит наиболее адекватной методикой для микроскопической диагностики болезни Альцгеймера и старческого слабоумия.

Материал фиксируют в 10 % формалине не менее 2 нед. Срезы толщиной 8—10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в 10 % формалине, перед окраской промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

1. Переносят срезы на 24 ч в 2 % раствор нитрата серебра.

2. Ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.

3. Переносят в аммиачное серебро на 25 — 30 с.

4. Тщательно ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.

5. Помещают в 20 % нейтральный формалин на 4 —5 с до приобретения темно-коричневой окраски.

6. Ополаскивают в дистиллированной воде.

7. Переносят 1—3 среза в 0, 5 % раствор трихлорида золота (они должны приобрести светло-серый, мышиный, цвет без коричневых пятен).

8. Переносят в дистиллированную воду (если на срезах появятся коричневые пятна, то вновь помещают в раствор трихлорида золота до их исчезновения).

9. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. Стеклянную палочку после погружения со срезом в тиосульфат натрия следует тщательно промыть в дистиллированной воде, протереть чистой тканью. Переносить срезы из тиосульфата натрия в трихлорид золота не следует, так как последний в этом случае темнеет и становится непригодным для использования.

10. Срезы промывают в дистиллированной воде, наклеивают на стекло, смазанное смесью белка с глицерином, затем ставят на ребро для просушки на 8 — 10 мин.

11. Просветляют в одной порции ксилола и заключают в бальзам под покровное стекло. Если препарат просветлен не полностью, т.е. имеются мутные пятна, то его следует погрузить на 2 — 3 с в ацетон, а затем вновь поместить в ксилол. Эту процедуру повторяют до полного просветления срезов.

Результат: на светлом фоне импрегнируются контуры нейронов, их ядер; в телах нейронов выявляются тонкие волокна нейрофибрилл или их патология. Между клетками видна тонкая сеть аксонов и их коллатералей. Аксосоматические терминали на поверхности тел нервных клеток выявляют изредка и частично, поэтому о количестве их говорить нельзя. Иногда в белом веществе обнаруживают волокнистые астроциты.

При правильной предварительной фиксации материала с помощью этого метода постоянно получают хорошие результаты. Засорение срезов осадками серебра происходит при использовании плохо обработанной посуды и недоброкачественного раствора серебра. При недостаточной дифференцировке в растворе трихлорида золота структуры выглядят грубо импрегнированными с коричневым оттенком, в срезе определяются коричневые пятна.

 

==========================================================

==========================================================

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГЛИИ

Методика Снесарева

(выявление волокнистой, астроцитарной глии и глиальных волокон)

Методика высокоизбирательна, позволяет выявить астроциты белого вещества ЦНС, глиальные волокна, а в нервных клетках — феномен центральной тинкториальной ацидофилии (ЦТА) и одновременно бета-зернистость [Снесарев П.Е., 1950]. Преимущество методики Снесарева перед методикой Рамон-и-Кахаля заключается в получении дифференцированной окраски органелл астроцитов (цитоплазма, ядро, отростки). Дополнительно выявляют эритроциты в сосудах и дренажную снесаревскую олигодендроглию.

Материал фиксируют в 10 % формалине.

Срезы толщиной 8— 10 мкм получают на замораживающем микротоме.

1. Ополаскивают срезы в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в профильтрованный 1 % водный раствор эритрозина (1 г эритрозина на 100 мл дистиллированной воды) на 20 — 30 с (в зависимости от восприимчивости красителя).

2. Срезы тщательно промывают в 2 и более сменах дистиллированной воды до прекращения отхождения краски.

3. Переносят в 0, 5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 35 —40 с.

4. Быстро промывают в дистиллированной воде, переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка и глицерина, тщательно протирают мягкой тканью стекло вокруг среза, промокают сложенной в 4 раза фильтровальной бумагой, а затем смоченной метилхлороформом (1 часть метилового спирта + 2 части хлороформа).

5. Стекла со срезами помещают в раствор Мая—Грюнвальда на 3 — 5 с.

6. Промывают в водопроводной воде в течение 3 — 5 с до удаления излишка красителя, протирают стекло тканью и промокают фильтровальной бумагой.

7. Обезвоживают в ацетоне, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.

Для приготовления 0, 5 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 200 мл дистиллированной воды берут 1 г фосфорно-молибденовой кислоты, взбалтывают. В полученном растворе имеется осадок. Раствор помещают на 2 — 3 ч в термостат при 37 — 40 °С, пока осадок не растворится (раствор должен быть абсолютно прозрачным).

Результат: на нежно-голубовато-синеватом фоне определяются такого же оттенка астроциты (ядро, цитоплазма, отростки). Вследствие патологических изменений астроцитарная клетка может настолько измениться, что патоморфоз в виде амебоидного астроцита бывает не всегда ясен. Ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе также имеют светло-синеватую окраску, иногда с розоватым оттенком (метахромазия). Феномен центральной тинкториальной ацидофилии принадлежит к гистохимическим реакциям, при этом центральная часть клетки — ядро и прилежащая цитоплазма, — становится розовой: от ярко­го цвета до едва заметного розоватого оттенка. Эритроциты в сосудах розового цвета.

Следует иметь в виду, что фосфорно-молибденовая кислота и метилхлороформ могут пережечь ткань (появляется дырчатость), излишек эритрозина обусловливает появление розовых пятен, при излишке раствора Мая — Грюнвальда и чрезмерной толщине срезов (более 8—10 мкм) срез становится грубым и тонкая структура астроцитов плохо дифференцируется.

 

==========================================================

Методика Рамон-и-Кахаля

(выявление волокнистой и астроцитарной глии)

Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 — 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине.

1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды).

2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место.

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин.

4. Переносят в дистиллированную воду, затем наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, подсушивают на воздухе до полного высыхания.

5. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.

Результат: в белом веществе на сиреневом фоне (разной интенсивности) четко определяются черновато-фиолетовые фиброзные астроциты, а в сером веществе — более светлые.

 

==========================================================


Поделиться:



Популярное:

Последнее изменение этой страницы: 2017-03-08; Просмотров: 657; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.033 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь