Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
Импрегнация замороженных срезов. ⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 5
Метод пригоден для исследования большого мозга, мозжечка, двигательных концевых пластинок, чувствительного эпителия. 1. Материал фиксируют в формалине (1: 4) 3 дня или дольше. 2. Замороженные срезы толщиной 30-40 мкм собирают в формалин. 3. После быстрого (несколько минут) промывания в дистиллированной воде помещают в смесь, состоящую из 12 мл 2 % раствора нитрата серебра, 7-10 капель пиридина и 5-6 мл 97 % спирта, в которой срезы за 4-6 ч должны стать светло-коричневыми; если этого не происходит, то следует в течение нескольких минут подогреть над пламенем. 4. Отдельные срезы на 2—4 с погружают в 100 % спирт. 5. Восстанавливают 1—3 мин в смеси, в состав которой входят 0, 3 г гидрохинона, 70 мл дистиллированной воды, 20 мл формалина и 15 мл ацетона. 6. Основательно промывают в воде, золотят и фиксируют как обычно. 7. Промывают, извлекают на предметное стекло, обсушивают фильтровальной бумагой. 8. Проводят через 100 % спирт, гвоздичное масло, ксилол, заключают в бальзам. В том случае, если с помощью этого метода не удается выявить мякотные волокна белого вещества, то перед серебряной ванной замороженные срезы 2 ч обрабатывают в смеси, состоящей из 10 мл 100 % спирта, 10 мл дистиллированной воды и 8-10 капель аммиака. Затем промывают, помещают в раствор нитрата серебра с пиридином и т.д.
========================================================== Метод Рамона—Лермитта (выявление дегенерированных синапсов) Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 — 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 — 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга — 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга — 60 мин, мозжечка и таламуса — 80 мин). После импрегнации срезы должны быть табачного цвета. 1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака). 2. Промывают в дистиллированной воде. 3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными. 4. Переносят в 0, 5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми. 5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин. 6. Промывают в дистиллированной воде (2 — 3 смены) 7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин. 8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.
========================================================== Методика Бильшовского (выявление внутриклеточных нейрофибрилл, Осевых цилиндров нервных волокон и сенильных бляшек) Служит наиболее адекватной методикой для микроскопической диагностики болезни Альцгеймера и старческого слабоумия. Материал фиксируют в 10 % формалине не менее 2 нед. Срезы толщиной 8—10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в 10 % формалине, перед окраской промывают в 3 сменах дистиллированной воды. 1. Переносят срезы на 24 ч в 2 % раствор нитрата серебра. 2. Ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды. 3. Переносят в аммиачное серебро на 25 — 30 с. 4. Тщательно ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды. 5. Помещают в 20 % нейтральный формалин на 4 —5 с до приобретения темно-коричневой окраски. 6. Ополаскивают в дистиллированной воде. 7. Переносят 1—3 среза в 0, 5 % раствор трихлорида золота (они должны приобрести светло-серый, мышиный, цвет без коричневых пятен). 8. Переносят в дистиллированную воду (если на срезах появятся коричневые пятна, то вновь помещают в раствор трихлорида золота до их исчезновения). 9. Переносят в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. Стеклянную палочку после погружения со срезом в тиосульфат натрия следует тщательно промыть в дистиллированной воде, протереть чистой тканью. Переносить срезы из тиосульфата натрия в трихлорид золота не следует, так как последний в этом случае темнеет и становится непригодным для использования. 10. Срезы промывают в дистиллированной воде, наклеивают на стекло, смазанное смесью белка с глицерином, затем ставят на ребро для просушки на 8 — 10 мин. 11. Просветляют в одной порции ксилола и заключают в бальзам под покровное стекло. Если препарат просветлен не полностью, т.е. имеются мутные пятна, то его следует погрузить на 2 — 3 с в ацетон, а затем вновь поместить в ксилол. Эту процедуру повторяют до полного просветления срезов. Результат: на светлом фоне импрегнируются контуры нейронов, их ядер; в телах нейронов выявляются тонкие волокна нейрофибрилл или их патология. Между клетками видна тонкая сеть аксонов и их коллатералей. Аксосоматические терминали на поверхности тел нервных клеток выявляют изредка и частично, поэтому о количестве их говорить нельзя. Иногда в белом веществе обнаруживают волокнистые астроциты. При правильной предварительной фиксации материала с помощью этого метода постоянно получают хорошие результаты. Засорение срезов осадками серебра происходит при использовании плохо обработанной посуды и недоброкачественного раствора серебра. При недостаточной дифференцировке в растворе трихлорида золота структуры выглядят грубо импрегнированными с коричневым оттенком, в срезе определяются коричневые пятна.
========================================================== ========================================================== МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГЛИИ Методика Снесарева (выявление волокнистой, астроцитарной глии и глиальных волокон) Методика высокоизбирательна, позволяет выявить астроциты белого вещества ЦНС, глиальные волокна, а в нервных клетках — феномен центральной тинкториальной ацидофилии (ЦТА) и одновременно бета-зернистость [Снесарев П.Е., 1950]. Преимущество методики Снесарева перед методикой Рамон-и-Кахаля заключается в получении дифференцированной окраски органелл астроцитов (цитоплазма, ядро, отростки). Дополнительно выявляют эритроциты в сосудах и дренажную снесаревскую олигодендроглию. Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8— 10 мкм получают на замораживающем микротоме. 1. Ополаскивают срезы в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в профильтрованный 1 % водный раствор эритрозина (1 г эритрозина на 100 мл дистиллированной воды) на 20 — 30 с (в зависимости от восприимчивости красителя). 2. Срезы тщательно промывают в 2 и более сменах дистиллированной воды до прекращения отхождения краски. 3. Переносят в 0, 5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 35 —40 с. 4. Быстро промывают в дистиллированной воде, переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка и глицерина, тщательно протирают мягкой тканью стекло вокруг среза, промокают сложенной в 4 раза фильтровальной бумагой, а затем смоченной метилхлороформом (1 часть метилового спирта + 2 части хлороформа). 5. Стекла со срезами помещают в раствор Мая—Грюнвальда на 3 — 5 с. 6. Промывают в водопроводной воде в течение 3 — 5 с до удаления излишка красителя, протирают стекло тканью и промокают фильтровальной бумагой. 7. Обезвоживают в ацетоне, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло. Для приготовления 0, 5 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 200 мл дистиллированной воды берут 1 г фосфорно-молибденовой кислоты, взбалтывают. В полученном растворе имеется осадок. Раствор помещают на 2 — 3 ч в термостат при 37 — 40 °С, пока осадок не растворится (раствор должен быть абсолютно прозрачным). Результат: на нежно-голубовато-синеватом фоне определяются такого же оттенка астроциты (ядро, цитоплазма, отростки). Вследствие патологических изменений астроцитарная клетка может настолько измениться, что патоморфоз в виде амебоидного астроцита бывает не всегда ясен. Ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе также имеют светло-синеватую окраску, иногда с розоватым оттенком (метахромазия). Феномен центральной тинкториальной ацидофилии принадлежит к гистохимическим реакциям, при этом центральная часть клетки — ядро и прилежащая цитоплазма, — становится розовой: от яркого цвета до едва заметного розоватого оттенка. Эритроциты в сосудах розового цвета. Следует иметь в виду, что фосфорно-молибденовая кислота и метилхлороформ могут пережечь ткань (появляется дырчатость), излишек эритрозина обусловливает появление розовых пятен, при излишке раствора Мая — Грюнвальда и чрезмерной толщине срезов (более 8—10 мкм) срез становится грубым и тонкая структура астроцитов плохо дифференцируется.
========================================================== Методика Рамон-и-Кахаля (выявление волокнистой и астроцитарной глии) Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 — 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине. 1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды). 2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место. 3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин. 4. Переносят в дистиллированную воду, затем наклеивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином, подсушивают на воздухе до полного высыхания. 5. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло. Результат: в белом веществе на сиреневом фоне (разной интенсивности) четко определяются черновато-фиолетовые фиброзные астроциты, а в сером веществе — более светлые.
========================================================== Популярное:
|
Последнее изменение этой страницы: 2017-03-08; Просмотров: 657; Нарушение авторского права страницы