Смесь применяют для серебрения глии по Рамон-и-Кахалю —Хортеге.

Окрашивание нервной ткани

При морфологических исследованиях нервной ткани на светооптическом уровне применяют большое количество методов окрашивания, многие из которых модифицированы. Чаще всего это избирательные (элективные) методы, используемые для выявления одного или двух элементов. С определенной целью применяют комбинированные методы.

ФИКСАЦИЯ

При изучении нервной ткани из простых фиксаторов наиболее часто используют 10 — 20 % раствор формальдегида и 96 % и 100 % спирт, из фиксирующих смесей — сулему и пиридин. Существуют также специфические фиксаторы, применяющиеся только при исследовании элементов нервной ткани.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления глии):

нейтральный формалин 15 мл

бромид аммония 20 г

дистиллированная вода 85 мл

Смесь применяют для серебрения глии по Рамон-и-Кахалю —Хортеге.

Продолжительность фиксации тонких (до 1, 5 см) кусочков материала 2 — 15 дней.

Промывание в проточной воде.

Фиксирующая смесь Рамон-и-Кахаля (для выявления нейро-фибрилл):

пиридин 40 мл

96 % спирт 30 мл

Продолжительность фиксации 2 ч.

Промывание в проточной воде в течение 1 ч.

ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

Особенностью обработки нервной ткани является ее тщательное обезвоживание. Для обезвоживания кусочков толщиной 5 —б мм используют следующую схему:

50 % спирт 2 ч

70 % спирт 6 ч

80 % спирт 6 ч

96 % спирт 6 ч

100 % спирт I 6 ч

100% спирт II 6 ч

Продолжительность обезвоживания 32 ч

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЗАЛИВКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ

Нервную ткань для гистологического исследования заливают в парафин, целлоидин и желатин. Методика заливки в парафин и целлоидин никаких особенностей обработки нервной ткани на этой стадии нет.

Заливка в желатин по Снесареву

Метод пригоден для эмбриологических исследований. Преимущество его заключается в том, что он не вызывает сморщивания материала. Рекомендуется для выявления тонкой межклеточной структуры соединительной ткани, а также для некоторых цитологических исследований.

Для заливки берут бесцветный прозрачный пищевой желатин и вначале из него готовят 25 % раствор. Для этого мелко нарезают нужное количество желатина, насыпают в широкогорлую банку и ставят в термостат при 37 °С до растворения. После этого часть приготовленного желатина разводят пополам теплым 1 % раствором фенола (карболовой кислоты) и таким образом получают 12, 5 % раствор. Растворы желатина лучше готовить в небольших количествах по мере надобности.

После фиксации тщательно промытый материал переносят в 12, 5 % раствор желатина, где держат в зависимости от величины кусочков от 1 — 2 ч до 1 — 2 сут, затем на такое же время переносят в 25 % раствор желатина при 37 °С. После заливки следуют быстрое охлаждение в холодильнике и уплотнение в 5— 10 % формалине. Блоки режут только на замораживающем микротоме.

ОКРАШИВАНИЕ НЕЙРОНОВ

Окрашивание метиленовым синим, которое Ниссль положил в основу изучения эквивалентной картины нервных клеток, основано на перекрашивании фиксированных в спирте срезов основным анилиновым красителем с последующим отмыванием его избытка спиртом. При этом составные части клеток сильнее удерживают краситель, чем масса волокон, которая дифференцируется быстрее. В результате интенсивно окрашенный клеточный материал резко выделяется на бесцветном фоне. В окрашивании клеток участвуют как ядерные структуры, так и вещества, находящиеся в цитоплазме нервных клеток, — тигроидные глыбки; глыбки, или вещество Ниссля.

Под эквивалентной картиной клетки F. Nissl понимал «картину микроскопической структуры имеющихся в ткани нервных клеток животного, убитого определенным образом, которая может быть закономерно воспроизведена при определенной микротехнике обработки нервной ткани, находящейся в определенных экспериментальных условиях».

Со временем метод Ниссля был упрощен. Даже основное требование F. Nissl - фиксация препаратов этиловым спиртом — выполняют частично, поскольку метод часто применяют для обработки материала, фиксированного в формалине. Однако в ответственных случаях следует рекомендовать по возможности проводить окрашивание материала, который был фиксирован по прописи в спирте. Что же касается указаний F. Nissl о резании и окрашивании, то их вполне можно заменить без ущерба для результата обычным спирт-целлоидиновым методом и более контрастным окрашиванием толуидиновым синим или тионином.

==========================================================

Метод Ниссля

Фиксация.

Острыми ножницами вырезают кусочки ткани мозга в форме кубиков и сразу, без соприкосновения с водой, помещают в большое количество 96 % спирта. Кусочки не должны быть ни слишком большими, ни слишком маленькими (длина сторон не менее 1 см). Важно, чтобы кусочек ткани со всех сторон омывался спиртом (положить на вату), который в 1-й день нужно сменить, по крайней мере, 1 раз, в дальнейшем обновлять каждые 2 дня.

Получение срезов.

Через 5 дней блок обычно достигает необходимой консистенции. Его сторону, предназначенную для наклейки, ровно срезают острой бритвой так, чтобы толщина блока не была более 6 — 8 мм, размер плоскости среза может быть любым. На ровную поверхность деревянной колодки, служащую для наклейки, наносят раствор гуммиарабика консистенции меда. Поверхность кусочка мозга промокают фильтровальной бумагой и легким нажимом вдавливают в раствор гуммиарабика так, чтобы он всюду хорошо прилегал к деревянной колодке. Затем блок переносят обратно в 96 % спирт, где гуммиарабик белеет и быстро уплотняется. Через несколько минут блок можно резать.

Блок режут косо поставленным ножом, смоченным спиртом, причем стараются срезы толщиной 10—15 мкм по возможности полностью расправить с помощью смоченной спиртом кисточки. Срезы собирают в чашку с 96 % спиртом. Долго хранить их в спирте нельзя, следует сразу же подготовить к окрашиванию. Блок, наоборот, можно хранить в спирте довольно долго: для этого его нужно снять с деревянной колодки.

Окрашивание срезов.

Срезы окрашивают в часовом стекле с красящим раствором, в состав которого входят 3, 75 г метиленового синего В, 1, 75 г наскобленного венецианского мыла, 1 л дистиллированной воды. Красящий раствор осторожно подогревают до появления паров. Затем расправленные срезы переносят для дифференцировки в свежеприготовленную смесь из 10 мл совершенно прозрачного анилинового масла и 90 мл 96 % спирта. Дифференцируют до прекращения отхождения крупных облачков краски. Затем срез помещают на предметное стекло, просушивают гладкой фильтровальной бумагой, быстро покрывают кайепутовым маслом, снова просушивают, поливают бензином (не давать подсохнуть! ) и покрывают канифолью с ксилолом (насыщенный раствор канифоли в ксилоле). Предметное стекло осторожно подогревают до испарения ксилола, после чего на еще горячий слой канифоли накладывают подогретое покровное стекло. Красящий раствор перед использованием взбалтывают и фильтруют.

Свежеприготовленный красящий раствор должен созревать не менее 3 мес. Этот метод является основной высоко специфической методикой окрашивания нервных клеток для изучения в них выраженных патологических и структурно-функциональных изменений в световом микроскопе. Основу его составляет способность выявлять с помощью основных красителей специфичный для нейронов нуклеопротеидный комплекс (тигроид), содержащийся в цитоплазме и дендритах, а также другие комплексы РНК и основных белков (ядрышко, хроматин ядра).

==========================================================

Окраска по Нисслю

==========================================================

Упрощенный метод Ниссля

Фиксированный в спирте материал заливают в спирт-целлоидин.

Срезы собирают в 70 % спирт, где их можно хранить долгое время.

Методика окраски

1. Расправленные срезы помещают в 0, 1 % раствор толуидинового синего или тионина, который после этого дважды нагревают до появления паров.

2. После охлаждения ополаскивают в воде и 70 % спирте.

3. Дифференцируют в 96 % спирте.

4. Проводят через 100 % спирт, ксилол, бальзам или окрашивают, как указано выше; дифференцируют в анилиновом масле со спиртом.

5. Извлекают срезы на предметное стекло, просушивают фильтровальной бумагой.

6. Просветляют кайепутовым маслом, затем масло сливают.

7. Просушивают, проводят через ксилол и заключают в бальзам.

Результат: глыбки тигроида, ядерная оболочка и ядрышки интенсивно синие или фиолетовые, цитоплазма ганглиозных и глиальных клеток бледно-синяя, волокнистое нервное вещество не окрашено.

==========================================================

ОКРАШИВАНИЕ НЕРВНЫХ ВОЛОКОН

Ускоренный метод Гольджи

1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2, 5 % (до 3, 5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 — 25 °С в коричневую склянку на стеклянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 — 6 кусочков. Кусочки не должны быть слишком большими или слишком маленькими (толщина 2 — 3 мм, площадь поверхности 5 — 10 мм2).

Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 — 7 дней с промежутками около 12 ч.

2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0, 75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до прекращения образования осадка, затем помещают на 1 — 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0, 75 % раствора нитрата серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.

3. Промывают в 40 % спирте (1 —2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 —4 ч, 4 % целлоидине 1 — 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.

Кусочки также можно поместить на 1—4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1: 1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.

Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.

После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.

Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.

Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 —10-дневные животные). Особенно благоприятными объектами являются головной и спинной мозг птенцов голубя.

Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 — 5 дней, для глии 2 — 3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.

Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.

Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1 — 14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2 — 3 % раствора бихромата калия и 4 —5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.

Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.

При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1 — 2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80—100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5 — 6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.

==========================================================

Медленный метод Гольджи

Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 — 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0, 75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.

Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом

Метод Гольджи—Дейнеки

(для выявления синапсов)

1. Материал фиксируют в свежем растворе АФА (состоит из равных частей 96 % спирта, 20 % нейтрального формалина и насыщенного раствора мышьяковистой кислоты) до 3 ч.

2. Промывают в 1 % растворе нитрата серебра и оставляют в этом растворе на срок от 18 дней до 2, 5 мес.

3. Промывают в дистиллированной воде 3 — 4 мин.

4. Переносят в восстановительную смесь, в состав которой входят 2 г гидрохинона, 0, 5 г сульфита натрия, 5 мл 40 % нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды, на 1 сут.

5. Промывают в дистиллированной воде.

6. Проводят через 70 %, 80 %, 96 % спирты по 3 ч в каждом и оставляют в 100 % спирте на ночь.

7. Переносят в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут, затем в 8 % целлоидин на 2 сут (лучше только в 6 % целлоидин на 2 — 3 сут).

8. После заливки на блоках готовят срезы толщиной от 15 до 30 мкм и переносят их в 70 % спирт.

9. Промывают срезы в дистиллированной воде и погружают до почернения в вираж (1, 5 г тиосульфата натрия, 1, 5 г тиоцианата аммония, 50 мл дистиллированной воды, на каждые 10 мл виража 1 мл 1 % трихлорида золота).

10. Промывают 10 — 30 мин водопроводной, затем дистиллированной водой.

11. Дифференцируют до просветления в растворе перманганата калия (2 — 3 кристалла на 50 мл дистиллированной воды + 1 капля серной кислоты).

12. Не промывая срезы, погружают их в 1 % раствор щавелевой кислоты на 1 — 3 мин (щавелевая кислота отмывает перманганат калия).

13. Промывают дистиллированной водой и переносят в спирты восходящей концентрации (50 %, 70 %, 96 %, 100 %) по 2 —3 мин.

14. Проводят через карбол-ксилол 1—2 мин, 2 — 3 порции ксилола и заключают.

Результат: фон препаратов светлый, тела нейронов и дендриты светло-серого цвета. Аксонные синаптические окончания импрегнируются интенсивно, дендриты — более интенсивно.

==========================================================

Методы Бильшовского

Предварительной обработкой материала для выявления нейрофибрилл, по Бильшовскому, служит фиксация нейтральным формалином. Оптимальная ее продолжительность — 3 — 6 нед после помещения в формалин, однако материал, лежавший в формалине несколько лет, также дает удовлетворительные результаты, особенно после обработки пиридином. Проводят окраску срезов (импрегнация срезов) или кусочков (тотальная импрегнация). Для получения хороших результатов необходимы точное соблюдение прописей (инструменты только стеклянные! ) и применение чистых реактивов.

Импрегнация срезов

Материал фиксируют в растворе формалина (1: 9) не менее 14 дней (максимальная толщина кусочков 1 см); промывают в проточной воде 2 —3 ч, затем в дистиллированной воде 1—2 дня; нарезают на замораживающем микротоме срезы толщиной.5 — 10 мкм и собирают в дистиллированную воду. Хорошие срезы вылавливают и промывают 1 — 2 раза в дистиллированной воде, которую меняют 3 — 4 раза.

Импрегнация:

1) срезы помещают в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч;

2) быстро (2 — 3 с) проводят через дистиллированную воду, сменяя стеклянные палочки;

3) помещают в свежеприготовленный раствор аммиачного серебра: к 10 мл 10 % раствора нитрата серебра добавляют 5 капель 40 % раствора гидроксида натрия — образуется коричнево-черный осадок окиси серебра. После этого при постоянном взбалтывании к раствору серебра по каплям добавляют раствор аммиака (молекулярная масса 0, 875 — 0, 910) до тех пор, пока от растворяющегося осадка останется лишь несколько крупинок. После каждой капли выжидают 10 — 20 с, прежде чем добавить следующую каплю. Необходимо избегать избытка аммиака. Раствор разводят до 20 мл дистиллированной водой. В раствор аммиачного серебра срезы помещают на 10 — 20 мин, в нем они должны приобрести желтоватый оттенок;

4) быстро проводят через 2 — 3 порции дистиллированной воды;

5) восстанавливают в растворе формалина (1: 4), не содержащем кислоты в течение 10 мин, — срезы быстро окрашиваются в темно-серый цвет;

6) промывают в воде 15 мин;

7) золотят в разбавленном растворе трихлорида золота (3 — 5 капель 1 % раствора желтого трихлорида золота на 10 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока коричневый тон не перейдет в серый или серо-фиолетовый;

8) фиксируют 1—2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия;

9) тщательно промывают в обычной воде (1—2 ч); проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол (не дольше, чем нужно) и заключают в бальзам.

На хорошо импрегнированных препаратах нейрофибриллы и перицеллюлярные сетчатые структуры ганглиозных клеток черного цвета выделяются на светлом фоне, так же отчетливо видны тончайшие осевые цилиндры.

К восстанавливающему 4 % раствору формалина можно добавить 1 % цитрат натрия в соотношении 1: 9. В этом случае картина, получающаяся в результате серебрения, очень равномерная и более контрастная.

==========================================================

Метод серебрения с предварительной обработкой пиридином

В тех случаях, когда материал предназначается главным образом для выявления осевых цилиндров, а не внутриклеточных нейрофибрилл, М. Бильшовский рекомендует предварительно обработать его пиридином (благодаря этому сильно подавляется подкраска глии и соединительной ткани). Фиксацию и предварительную подготовку материала проводят по методу Бильшовского. Замороженные срезы промывают в дистиллированной воде 1 — 2 ч и переносят в неразведенный пиридин на 24— 48 ч. Затем срезы тщательно освобождают от пиридина, промывая их в часто сменяемой дистиллированной воде до тех пор, пока не исчезнет специфический запах пиридина. После этого переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 24 ч и далее обрабатывают по методу Бильшовского.

Тотальная импрегнация

Импрегнацию целого кусочка проводят с предварительной обработкой пиридином или без нее. В последнем случае кусочки ткани размером не более 1 см3 фиксируют в формалине и без промывания переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 1 — 8 дней (в зависимости от величины). Затем перекладывают на 0, 5 — 6 ч в раствор аммиачного серебра, быстро проводят через дистиллированную воду и помещают в 20 % раствор формалина на 12 —24 ч. После этого материал как можно быстрее заливают в парафин.

Более надежной является тотальная импрегнация с пиридином по Билшовскому.

1. Органы, фиксированные не менее 1 нед в нейтральном формалине (от 1: 4 до 1: 9), разрезают на кусочки толщиной не более 0, 5 см и на 3 — 4 дня помещают в чистый неразведенный пиридин при комнатной температуре.

2. Промывают 12 — 24 ч в проточной воде и столько же в часто сменяемой дистиллированной воде.

3. Пропитывают в 3 % растворе нитрата серебра при 36 °С 3 — 5 дней.

4. Быстро ополаскивают в дистиллированной воде.

5. Помещают на 24 ч в раствор аммиачного серебра (готовят так же, как для импрегнации срезов, но доливают дистиллированной водой до 100 мл).

6. Промывают в часто сменяемой воде (по Билшовскому до 1 ч в зависимости от толщины блока, по Буке, 2 ч).

7. Восстанавливают в нейтральном формалине (1: 9) 10 — 12 ч.

8. Ополаскивают в дистиллированной воде, быстро проводят через спирты, заливают в парафин; золочение и фиксацию проводят на срезах.

При тотальной импрегнации с применением пиридина можно использовать материал, находившийся в формалине в течение нескольких лет. При этом методе глия и соединительная ткань обычно отступают на задний план или выделяются благодаря иному тону окраски. Фибриллярные структуры ганглиозных клеток выявляются менее четко, чем при использовании оригинального метода, моторные и чувствительные концевые образования нервов, наоборот, видны отчетливо.

Нередко импрегнация протекает хорошо не во всем кусочке, а лишь в его определенных зонах. Более благоприятные результаты наблюдаются в эмбриональных тканях, которые легче пропитываются.

М. Бильшовский рекомендует использовать для восстановления серебра не формалин, а смесь, состоящую из 75 мл 30 % раствора фруктозы, 75 мл 10 % раствора сегнетовой соли, 20 мл 10 % раствора карбоната калия и 5 мл чистого формалина. Импрегнированные блоки помещают в эту смесь на 24 ч при 50 °С. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, обезвоживание и заливка.

Смесь может быть применена и для восстановления импрегнированных срезов. В этом случае срезы после пропитывания в растворе аммиачного серебра быстро ополаскивают и переносят на 1 — 2 мин в указанный раствор, подогретый до 50 °С. Затем следуют промывание, золочение и т.п.

С помощью восстанавливающей смеси по Бильшовскому особенно хорошо выявляются перицеллюлярные концевые образования в ЦНС.

==========================================================

Метод Адэра и Витгилию

(для выявления нейрофибрилл и синапсов)

Головной мозг кошки фиксируют в дважды сменяемом ацетоне по 24 ч в каждом. Заливают в парафин в течение 18 — 24 ч. Срезы толщиной 15—20 мкм депарафинируют, промывают в 100 % спирте и опускают на 6 ч в 1 % раствор аммиака на абсолютном спирте. Затем погружают на 6 ч в пиридин. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 2 % раствор нитрата серебра на 12 ч при температуре 30 °С, затем промывают в 100 % спирте. Восстанавливают серебро в растворе пирогалловой кислоты с формалином (95 мл 95 % спирта, 3 г пирогалловой кислоты и 8 мл формалина).

Далее проводят через дважды сменяемый спирт, промывают несколько раз в дистиллированной воде и обрабатывают 1 % трихлоридом золота до обесцвечивания. Промывают в 6 —8 порциях дистиллированной воды.

Для усиления окраски срезы обрабатывают 3 — 4 мин в 1 % растворе щавелевой кислоты. Снова промывают в 6-8 порциях дистиллированной воды и погружают на 5—10 мин в 10 % раствор тиосульфата натрия. Далее промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилолах и заключают в бальзам.

Результат: хорошо выражены нейрофибриллы черного цвета, видны конечные колечки и колбочки.

==========================================================

Методы Рамон-и-Кахаля

Методы импрегнации нейрофибрилл, предложенные S. Ramon y Cajal, применяют преимущественно в форме тотальной импрегнации. Принцип методов основан на том, что свежевзятые кусочки ткани сразу или после фиксации спиртом пропитывают раствором нитрата серебра, а образовавшиеся при этом соединения серебра восстанавливают при последующей обработке пирогалловой кислотой или гидрохиноном.

Недостаток методов состоит в том, что в импрегнированном кусочке пригодной для исследования обычно оказывается лишь средняя зона, так как раствор серебра не проникает в глубокие слои. Наружная зона не может быть исследована вследствие сильного зачернения. Кроме того, часто происходит значительное сжатие ткани, в связи с чем общая сохранность препарата во многих случаях оказывается не очень хорошей. В новых модификациях метода импрегнации на срезах эти недостатки устраняются.

В растворах серебра препараты должны находиться все время в отсутствие света (коричневые склянки с пришлифованными пробками, обертки из картона и т.п.). Кусочки ткани не должны быть толще 3 мм.

Метод I.

Пригоден для исследования головного мозга мелких животных, а также эмбрионов и новорожденных крупных животных, позволяет выявить пирамидные клетки большого мозга и клетки-зерна мозжечка.

1. Свежевзятые кусочки ткани помещают на 3 — 5 дней в 0, 75 — 3 % раствор нитрата серебра при 35 °С до появления табачно-коричневой окраски кусочков.

2. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

3. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1 — 2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде 5 мин.

5. Заливают в целлоидин или парафин.

Обезвоживать следует по возможности быстро, около 5-6 ч.

Для обработки материала, взятого у новорожденных и эмбрионов, берут 0, 75 % раствор нитрата серебра, у взрослых млекопитающих—3 %, у беспозвоночных—6 % раствор. На 2—3 кусочка расходуют 80—100 мл раствора.

Метод II.

Пригоден для выявления мякотных и безмякотных нервных волокон, перицеллюлярных разветвлений, больших и средних нервных клеток, особенно головного мозга, мозжечка, спинного мозга и, кроме того, двигательных и чувствительных нервных окончаний и регенерационных стадий.

1. Материал фиксируют в 96 % или 100 % спирте 24 ч.

2. Разрезают на кусочки толщиной 2, 5—3 мм, импрегнируют 5—7 дней в 1—1, 5 % растворе нитрата серебра при 30—35 °С.

3. Ополаскивают дистиллированной водой 1 мин.

4. Восстанавливают 24 ч в смеси, состоящей из 1—2 г пирогалловой кислоты или гидрохинона, 5 мл нейтрального формалина и 100 мл дистиллированной воды.

5. Ополаскивают дистиллированной водой 5 мин.

6. Заливают в парафин или целлоидин; обезвоживать следует по возможности быстрее (примерно 5-6 ч).

В том случае, если импрегнация слишком светлая, срезы 5 — 10 мин обрабатывают в смеси, состоящей из 3 г тиоцианата аммония. 3 г тиосульфата натрия, 100 мл дистиллированной воды и нескольких капель 1 % раствора трихлорида золота. Если к спирту, используемому для фиксации, добавить веронал, хлоралгидрат и т.п. (на 50 мл 1 г), то для импрегнации в растворе нитрата серебра потребуется только 5 дней. Это делает метод более надежным, и он может быть применен на материале, долгое время лежавшем в спирте.

Метод III.

Особенно показан для выявления нейрофибрилл спинного мозга, чувствительных симпатических ганглиев человека, кошки, собаки, кролика.

Материал фиксируют 24 ч в смеси 50 мл 96 % или 100 % спирта и 1—12 капель (для большого мозга 1—3 капли, мозжечка—4, спинного и продолговатого мозга—8—12, периферических окончаний — 2 —3) раствора аммиака (молекулярная масса 0, 910). Если аммиака добавлено слишком много, то импрегнация получается бледная. Сжатие можно уменьшить, если объект вначале поместить на 6 ч в 70 % спирт, затем на 2—4 ч в 85 % спирт и лишь после этого перенести в аммиачный спирт. После обсушивания фильтровальной бумагой обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод IV.

Пригоден для выявления безмякотных волокон ЦНС, перицеллюлярных разветвлений, моховидных волокон мозжечка.

Материал фиксируют в смеси 15 мл формалина и 85 мл воды; промывают в проточной воде 6 — 12 ч; помещают на 24 ч в 50 мл 96 % спирта, к которому добавлено 5 капель раствора аммиака; обсушивают фильтровальной бумагой; далее обработку проводят так же, как при использовании метода II.

Метод V.

Хорошие результаты получают на эмбрионах, а у взрослых прежде всего при изучении нейрофибрилл, нервных окончаний и процесса регенерации нервов (за исключением первых стадий).

Материал фиксируют 24 ч в 70 % пиридине или смеси, состоящей из 40 частей пиридина и 30 частей 95 % спирта; промывают в проточной воде до исчезновения запаха 12—24 ч; переносят на 6-12 ч в 95 % спирт; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод VI.

Пригоден для изучения двигательных концевых пластинок, перицеллюлярных разветвлений, мозжечка.

Материал фиксируют 24 ч в смеси, состоящей из 5 г хлоралгидрата, 25 мл 100 % спирта и 75 мл дистиллированной воды; ополаскивают в дистиллированной воде 1 мин; помещают на 24 ч в 50 мл 100 % спирта, в который добавлено 4 капли раствора аммиака; промывают 12 — 24 ч в проточной воде и 2 — 5 ч в часто сменяемой дистиллированной воде; далее обработку ведут так же, как при использовании метода II.

Метод Рамона—Лермитта

(выявление дегенерированных синапсов)

Материал фиксируют в 10 % нейтральном формалине в течение 1-2 нед или дольше. Затем его переносят на 1 ч в 40 % формалин, 2 ч промывают в проточной воде и 2 ч -в дистиллированной. Срезы толщиной 15 — 20 мкм получают на замораживающем микротоме. Из дистиллированной воды их переносят в 20 % раствор нитрата серебра при температуре 50 — 53 °С (продолжительность пребывания в этом растворе срезов спинного мозга — 50 мин, продолговатого мозга и коры головного мозга — 60 мин, мозжечка и таламуса — 80 мин). После импрегнации срезы должны быть табачного цвета.

1. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, на 5-10 мин переносят в раствор аммиачного серебра (в 20 % раствор нитрата серебра добавлять по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка в мерном стаканчике, а затем добавляют столько же раствора аммиака).

2. Промывают в дистиллированной воде.

3. Восстанавливают в формалине (1 часть формалина, 2 части водопроводной воды и 2 части дистиллированной воды) 15 мин, срезы должны стать коричнево-черными.

4. Переносят в 0, 5 % раствор трихлорида, золота и держат до тех пор, пока срезы не станут серыми.

5. Закрепляют в 3 % растворе тиосульфата натрия 5 мин.

6. Промывают в дистиллированной воде (2 — 3 смены)

7. Обезвоживают в 40 % и 96 % спирте по 10 мин.

8. Просветляют в 10 % карбол-ксилоле и 2 смесях ксилола по 10 мин, заключают в бальзам.

==========================================================

Методика Бильшовского

(выявление внутриклеточных нейрофибрилл,

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГЛИИ

Методика Снесарева

(выявление волокнистой, астроцитарной глии и глиальных волокон)

Методика высокоизбирательна, позволяет выявить астроциты белого вещества ЦНС, глиальные волокна, а в нервных клетках — феномен центральной тинкториальной ацидофилии (ЦТА) и одновременно бета-зернистость [Снесарев П.Е., 1950]. Преимущество методики Снесарева перед методикой Рамон-и-Кахаля заключается в получении дифференцированной окраски органелл астроцитов (цитоплазма, ядро, отростки). Дополнительно выявляют эритроциты в сосудах и дренажную снесаревскую олигодендроглию.

Материал фиксируют в 10 % формалине.

Срезы толщиной 8— 10 мкм получают на замораживающем микротоме.

1. Ополаскивают срезы в 2 сменах дистиллированной воды и помещают в профильтрованный 1 % водный раствор эритрозина (1 г эритрозина на 100 мл дистиллированной воды) на 20 — 30 с (в зависимости от восприимчивости красителя).

2. Срезы тщательно промывают в 2 и более сменах дистиллированной воды до прекращения отхождения краски.

3. Переносят в 0, 5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 35 —40 с.

4. Быстро промывают в дистиллированной воде, переносят на предметное стекло, смазанное смесью белка и глицерина, тщательно протирают мягкой тканью стекло вокруг среза, промокают сложенной в 4 раза фильтровальной бумагой, а затем смоченной метилхлороформом (1 часть метилового спирта + 2 части хлороформа).

5. Стекла со срезами помещают в раствор Мая—Грюнвальда на 3 — 5 с.

6. Промывают в водопроводной воде в течение 3 — 5 с до удаления излишка красителя, протирают стекло тканью и промокают фильтровальной бумагой.

7. Обезвоживают в ацетоне, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло.

Для приготовления 0, 5 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты на 200 мл дистиллированной воды берут 1 г фосфорно-молибденовой кислоты, взбалтывают. В полученном растворе имеется осадок. Раствор помещают на 2 — 3 ч в термостат при 37 — 40 °С, пока осадок не растворится (раствор должен быть абсолютно прозрачным).

Результат: на нежно-голубовато-синеватом фоне определяются такого же оттенка астроциты (ядро, цитоплазма, отростки). Вследствие патологических изменений астроцитарная клетка может настолько измениться, что патоморфоз в виде амебоидного астроцита бывает не всегда ясен. Ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе также имеют светло-синеватую окраску, иногда с розоватым оттенком (метахромазия). Феномен центральной тинкториальной ацидофилии принадлежит к гистохимическим реакциям, при этом центральная часть клетки — ядро и прилежащая цитоплазма, — становится розовой: от яркого цвета до едва заметного розоватого оттенка. Эритроциты в сосудах розового цвета.

Следует иметь в виду, что фосфорно-молибденовая кислота и метилхлороформ могут пережечь ткань (появляется дырчатость), излишек эритрозина обусловливает появление розовых пятен, при излишке раствора Мая — Грюнвальда и чрезмерной толщине срезов (более 8—10 мкм) срез становится грубым и тонкая структура астроцитов плохо дифференцируется.

==========================================================

Методика Рамон-и-Кахаля

(выявление волокнистой и астроцитарной глии)

Материал фиксируют в 10 % формалине. Срезы толщиной 8 — 10 мкм получают на замораживающем микротоме, хранят в свежем 10 % кислом формалине.

1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят на 2 сут в свежий бромистый фиксатор (14 мл нейтрального формалина, 2 г бромида аммония и 100 мл дистиллированной воды).

2. Тщательно промывают в 3 сменах дистиллированной воды и переносят в раствор трихлорида золота с сулемой (8 мл 5 % прозрачного раствора сулемы, 10 мл 1 % раствора трихлорида золота и 60 мл дистиллированной воды) на 1 сут в темное место.

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды и помещают в 5 % раствор тиосульфата натрия на 1 мин.

12 3 4 5 Следующая ⇒