Метод Шпильмейера в модификации Соколянского

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 5Следующая ⇒

Данный метод применяют для выявления миелиновых оболочек нервных волокон. С его помощью более четко определяется волоконная архитектоника и структура волокна, но хуже окрашивается миелин. Одновременно окрашивается дренажная олигодендроглия в белом веществе (при окраске головного мозга крыс лучше применять модификацию Соколянского).

Материал фиксируют в формалине.

Срезы толщиной 10 — 15 мкм получают на замораживающем микротоме.

Методика окраски

1. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

2. Переносят на смазанное белком покровное стекло и подсушивают.

3. Помещают в насыщенный раствор бихромата калия на 24 ч (можно на несколько суток) и держат на свету.

4. Ополаскивают в дистиллированной воде.

5. Переносят в 2, 5 % раствор железоаммонийных квасцов и держат в темноте 24 ч (можно дольше).

6. Ополаскивают в дистиллированной воде (необязательно).

7. Окрашивают в течение 24 ч (можно дольше) на свету в гематоксилине (15 мл гематоксилина Бемера + 85 мл дистиллированной воды).

8. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды.

9. Дифференцируют в 2, 5 % растворе железоаммонийных квасцов.

10. Промывают в дистиллированной и проточной воде, проводят через 96 % спирт, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.

Результат: на сероватом фоне миелиновая оболочка центральных нервных волокон сиреневая; ядра дренажной олигодендроглии в белом веществе такого же оттенка.

==========================================================

Выявление миелиновой и нейрокератиновой оболочек по Авцыну

Материал фиксируют в формалине, заливают в желатин. Срезы толщиной до 10 мкм отмывают от формалина в 2 сменах дистиллированной воды, затем помещают в спиртовой раствор пиридина (чистый пиридин + 96 % спирт в соотношении 1: 1) на 1 сут.

Методика окраски

1. Срезы промывают в 3 — 5 сменах дистиллированной воды и помещают в 0, 5 % раствор нитрата серебра.

2. Ополаскивают в 3 сменах дистиллированной воды.

3. Переносят в 10 % нейтральный формалин (3 порции, в каждой по 3 мин).

4. Ополаскивают в 3 сменах дистиллированной воды.

5. Опускают в фосфорно-молибденовое серебро на 30 с.

6. Быстро ополаскивают в 2 сменах дистиллированной воды.

7. Переносят в 10 % нейтральный формалин на 2 мин.

8. Погружают в дистиллированную воду, контролируя процесс под микроскопом.

9. Переносят в фосфорно-молибденовое серебро (в той же банке).

10. Помещают в 10 % нейтральный формалин на 2 мин. И. Ополаскивают в дистиллированной воде.

12. Переносят в фосфорно-молибденовое серебро (так до 3 — 4 раз, а для выявления тангенциальных волокон — до 7 раз).

13. Переносят в дистиллированную воду, контролируя процесс под микроскопом.

14. Осторожно натягивают на предметное стекло, смазанное смесью белка с глицерином.

15. Подсушивают на воздухе 8—10 мин, проводят через ксилол и заключают в бальзам.

Для приготовления фосфорно-молибденового серебра берут 4 мл 20 % раствора нитрата серебра и 1 мл 1 % раствора фосфорно-молибденовой кислоты, добавляют по каплям 25 % раствор аммиака до растворения осадка, доливают до 15 мл дистиллированной воды.

Результат: на светло-сиреневом фоне определяются нейрокератиновая и миелиновая оболочки нервных волокон черного цвета; в сосудах выявляются эритроциты черного цвета.

Для получения этих результатов требуется тщательное соблюдение методических рекомендаций: свежий, прозрачный раствор фосфорно-молибденового серебра, соответствующей толщины срезы, химически чистая посуда. В противном случае фон становится интенсивно коричневым, а серебро, применяемое для выявления нервных волокон, выпадает в осадок в виде зерен черного цвета.

==========================================================

Выявление оболочек нервных волокон по Хеквисту

Материал (кусочки ткани размером до 3 см) фиксируют в формалине, продолжительность фиксации не ограничена. После фиксации кусочек промывают до исчезновения запаха формалина.

Затем кусочки помещают в 5 % раствор бихромата калия на 14 дней, промывают в проточной воде 24 ч, проводят через спирты (70 %, 96 % и 100 %) и заливают в парафин.

Методика окраски

1. Срезы проводят через 100 %, 96 %, 80 %, 70 % спирты и дистиллированную воду.

2. Переносят в 0, 5 % раствор фосфорно-молибденовой кислоты на ночь. Одновременно готовят краситель (35 мл 1 % водного раствора метиленового синего + 35 мл 1 % водного раствора желтого или красного эозина, через 1 сут после приготовления растворы сливают и добавляют 120 мл воды).

3. Срезы быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят на ночь в краситель.

4. Ополаскивают в воде, быстро проводят через спирты и ксилол, заключают в бальзам.

Результаты: на синем фоне ткани миелиновая оболочка нервных волокон приобретает окраску от розовой до ярко-красной, осевые цилиндры окрашиваются в темно-синий цвет.

Рисунок миелинового волокна может иметь размытый фон при задержке ополаскивания в воде.

==========================================================

ВЫЯВЛЕНИЕ ГАНГЛИЕВ И ИХ ОТРОСТКОВ

Среди методов импрегнации металлами первое место занимают методы импрегнации серебром Гольджи. Они основаны на образовании соединений серебра, которые осаждаются на отдельных ганглиозных клетках и их отростках, а также часто на глиальных клетках, сосудах и других образованиях. Наиболее распространен так называемый быстрый метод Гольджи. Во многих случаях вместо него можно использовать простой метод серебрения Шультце. Недостатком, но в то же время и достоинством метода Гольджи является то, что импрегнация никогда не распространяется на все клетки, ограничиваясь отдельными элементами. Благодаря этому получается картина, хотя и не полная, но более ясная, чем если бы были выявлены все клетки.

Метод Гольджи имеет большое значение не только для импрегнации нервных клеток, но и для выявления нервных окончаний, секреторных капилляров, железистых ходов, границ клеток и т.п. Хотя метод Гольджи позволяет получить лишь теневую картину, в соответствующих случаях с его помощью с успехом выявляют разнообразные тканевые элементы. При его использовании, конечно, нужно постоянно сознавать, что выявление структур основано на образовании осадка, который при известных обстоятельствах может дать картину не существующих в действительности структур. Нужно также учитывать, что выявленные клетки или структуры могут оказаться неполно импрегнированными. Какие именно образования будут импрегнированы, является в известной степени делом случая, так как условия, при которых происходит образование осадка, к сожалению, еще недостаточно известны. В связи с этим для правильной оценки полученных результатов требуются знания и опыт.

Ускоренный метод Гольджи

1. Кусочки ткани, по возможности свежей, помещают в смесь из 40 мл 2, 5 % (до 3, 5 % по Кахалю) бихромата калия и 10 мл 4 % тетраоксида осмия при 20 — 25 °С в коричневую склянку на стеклянную вату так, чтобы жидкость проникала со всех сторон. Указанного количества, жидкости достаточно для 5 — 6 кусочков. Кусочки не должны быть слишком большими или слишком маленькими (толщина 2 — 3 мм, площадь поверхности 5 — 10 мм2).

Продолжительность воздействия заранее нельзя указать, так как для каждого объекта она различна, поэтому всегда кладут в смесь большое количество кусочков и вынимают их из раствора в течение 2 — 7 дней с промежутками около 12 ч.

2. Кусочки обсушивают фильтровальной бумагой и погружают в небольшое количество 0, 75 % раствора нитрата серебра, который в случае необходимости несколько раз меняют до прекращения образования осадка, затем помещают на 1 — 2 дня (на 1-6 дней по Рамон-и-Кахалю) в 100 мл 0, 75 % раствора нитрата серебра при комнатной температуре или 35 °С (не выше), лучше в темноте.

3. Промывают в 40 % спирте (1 —2 ч), сменяя его несколько раз. Переносят в 80 % и 96 % спирты. Затем кусочки зажимают в уплотненную печень или проклеивают гуммиарабиком и режут бритвой или на микротоме, смачивая спиртом (толщина срезов 20-100 мкм). Если кусочки после уплотнения в спирте перенести обратно в воду, то их можно резать и на замораживающем микротоме. Кусочки можно также быстро залить в целлоидин, для чего их обезвоживают в 100 % спирте 12 ч, спирт-эфире 2 —4 ч, 4 % целлоидине 1 — 2 дня, накладывают на деревянный или лучше стабилитовый блок, обливают густым раствором целлоидина и уплотняют на воздухе или в 80 % спирте. Если ткань при резке сильно крошится, то блок после каждого среза смазывают жидким раствором целлоидина.

Кусочки также можно поместить на 1—4ч в 100% спирт, на 1 ч в смесь 100 % спирта и эфира (1: 1), а затем на несколько часов в жидкий целлоидин (в сосуд со свободно сидящей пробкой). После этого объект уплотняют в парах хлороформа и режут в 96 % спирте.

Срезы тщательно промывают в 80 % спирте для удаления избытка серебра, обезвоживают в абсолютном спирте, просветляют в креозоте, а затем в скипидаре.

После этого срезы переносят на покровное стекло, осторожно отсасывают масло и наносят каплю густого бальзама, которую распространяют по всему препарату. В таком виде препарат оставляют на несколько дней сохнуть в месте, защищенном от пыли, и, наконец, укрепляют покровное стекло срезом вниз на продырявленном предметном стекле или деревянной дощечке. Таким образом, препарат не следует заключать между предметным и покровным стеклами, так как в этом случае импрегнация разрушается в короткий срок.

Результат: при удавшейся импрегнации на светлом фоне выделяются отдельные темно-черные ганглиозные клетки вместе с отростками.

Наиболее легко удается импрегнация ганглиозных клеток на материале, взятом от молодых животных (поздние эмбрионы, 1 —10-дневные животные). Особенно благоприятными объектами являются головной и спинной мозг птенцов голубя.

Выраженное влияние на результаты оказывает продолжительность хромирования. Точные рекомендации, к сожалению, дать невозможно, так как для каждого объекта она различна и зависит от состояния препарата, температуры, концентрации, количества жидкости и др. Сроки устанавливают чисто эмпирически: для ганглиозных клеток ЦНС обычно 3 — 5 дней, для глии 2 — 3 дня, для нервных волокон 5-7 дней. При слишком кратковременном хромировании появляется лишь диффузный осадок хромата серебра, при слишком длительном находят только резко отграниченные кристаллы, импрегнация же отсутствует.

Кусочки ткани обычно окружены толстым слоем осадка серебра, который может затруднять наблюдение, особенно в случае тонких препаратов мембран, так как покрывает большую часть препарата. В связи с этим перед помещением кусочков в раствор нитрата серебра целесообразно несколько раз быстро погрузить их в 10 % раствор желатина, т.е. окружить желатиновой оболочкой. После серебрения от желатина освобождаются путем быстрого погружения кусочков в теплую воду, насыщенную хроматом серебра.

Объекты, находившиеся слишком долго в растворах, содержащих хром, еще могут быть пригодны для импрегнации по Гольджи, если их обрабатывать в течение 1 — 14 дней в часто сменяемой смеси равных частей 2 — 3 % раствора бихромата калия и 4 —5 % раствора сульфата меди; из этой смеси объект переносят в ванну с нитратом серебра.

Надежность метода Гольджи повышается при 2- или 3-кратном импрегнировании по Кахалю. Благодаря этому часто можно «спасти» импрегнацию, оказавшуюся в первый раз неудачной.

При повторном импрегнировании поступают так, как при использовании метода Гольджи (быстрого). Обсушивают кусочек на фильтровальной бумаге и помещают в ранее использовавшуюся смесь бихромата калия и тетраоксида осмия, а затем на 1 сут в раствор нитрата серебра, применявшийся ранее. Ополаскивают дистиллированной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Погружают на 1 — 2 мин в 96 % спирт, обсушивают фильтровальной бумагой. Делают блок с помощью гуммиарабика или парафина и режут, смачивая 96 % спиртом. Толщина срезов 80—100 мкм; срезы промывают в 96 % спирте, сменяемом 5 — 6 раз, в общей сложности не дольше 30 мин. Переносят на предметное стекло, прижимают фильтровальной бумагой и заключают (по методу Гольджи). Приведенные выше процедуры можно повторить и в 3-й раз.

==========================================================

Медленный метод Гольджи

Маленькие кусочки органов помещают в жидкость Мюллера или 3 % раствор бихромата калия, концентрацию которого постепенно повышают до 5 % (в сосуде из коричневого стекла). Через 4 — 6 недель проводят первую пробу; для этого один кусочек обсушивают фильтровальной бумагой, ополаскивают в 0, 75 % растворе нитрата серебра, а затем кладут в такой же раствор на 24 ч. Если на сделанных бритвой срезах с материала не обнаруживают никакой импрегнации, то пробу повторяют через 8 дней. После того как наступит импрегнация, материал обрабатывают по методу Гольджи, начиная с пункта 3.

Специальные методики импрегнации нервных клеток с отростками и контактным аппаратом

⇐ Предыдущая 1 234 5 Следующая ⇒