МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ

Изоляция эпителиальных клеток и их окрашивание.

Изоляцию клеток лучше всего проводить в 30% спирте. Небольшие кусочки нефиксированного органа (например, трахеи) помещают в небольшой объем спирта (превышающий объем материала не более чем в 3 раза) и оставляют на 12—24 ч. После этого изоляция достигается уже при встряхивании или при легком поколачивании материала препаровальной иглой. Затем несколько капель мацерированной ткани размазывают препаровальной иглой по предметному стеклу, влажный мазок помещают на 20—30 мин в жидкость Буэна, далее в 50% спирт, дистиллированную воду, окрашивают гематоксилин -эозином или азур-2-эозином. Кусочек ткани после мацерации до выделения клеток можно тотально окрасить квасцовым кармином в течение 0, 5—12 ч.

Приготовление красителя: в 100 мл горячей дистиллированной воды растворяют 6 г хромовых квасцов, добавляют 1 г кармина, помешивают 15 мин, кипятят и после их охлаждения фильтруют.

После окрашивания следуют основательная промывка в дистиллированной воде, выделение клеток, обезвоживание, помещение в ксилол, бальзам.

Результат: ядра черно-синие, цитоплазма бледная сине-фиолетовая.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СОЕДИНИТЕЛЬНЫХ ТКАНЕЙ

Приготовление пленочных препаратов рыхлой волокнистой соединительной ткани и окрашивание их железным гематоксилином по методу Ясвоина.

Приготовление растворов: 1. Раствор гематоксилина: 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, приливают 90 мл дистиллированной воды и оставляют до созревания (раствор должен приобрести красный цвет). 2. 6% раствор железоаммиачных квасцов. Непосредственно перед употреблением растворы смешивают на часовом стекле в таком отношении, чтобы осадок выпал не раньше чем через 0, 5 мин, т. е. через срок, достаточный для окрашивания препарата. Если осадок выпадает через более длительный срок, препарат будет окрашен недостаточно контрастно. В среднем к 5 каплям квасцов прибавляют, встряхивая, 10—12 капель гематоксилина (добавляют гематоксилин в квасцы, а не наоборот).

Изготовление пленочных препаратов. Кожу вместе с подкожной соединительной тканью фиксируют в 10% нейтральном формалине (см. главу 21). Дальнейшую обработку можно проводить через несколько часов, а можно и отложить на 10—15 дней (не более, так как, если материал перестанет быть бархатистым, а станет жестковатым, он уже не годится для дальнейшей обработки). Из находящейся на поверхности стекловидно-прозрачной соединительной ткани острыми ножницами вырезают узкую полоску, помещают ее на предметное стекло, смазанное белком с глицерином и приступают к ее растягиванию двумя препаровальными иглами. Полоске надо дать слегка подсохнуть. Если она будет слишком влажной, она будет не растягиваться, а перемещаться по стеклу из стороны в сторону, если слишком высохнет, вообще не будет растягиваться. В результате растягивания должна получиться тонкая пленка. Не давая пленке окончательно высохнуть, ее помещают на 5 мин в 96% спирт. Затем предметное стекло с прилипшей к нему пленкой помещают в 70% спирт и, наконец, в дистиллированную воду на 5-10 мин.

Методика окрашивания.

Приготовленный краситель, на несколько секунд наливают на препарат. Когда выпадает осадок, препарат поливают большим количеством водопроводной воды, промывание продолжают в течение 15—30 мин. Сливать краситель с препарата нельзя, иначе осадок плотно пристанет к ткани.

Окрашивание эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта.

Приготовление растворов:

1. Раствор резорцин - фуксина (фуксилина).

В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г основного фуксина и 4 г резорцина, доводя до кипения, и прибавляют 25 мл официального раствора полуторахлористого железа (официальный раствор полуторахлористого железа представляет собой 50% раствор водного хлорного железа(III). — FeСI3*6Н2О). Раствор кипятят в течение 5 мин, все время помешивая, охлаждают и фильтруют. Фильтрат вынимают, а фильтр с образовавшимся на нем осадком после высыхания снимают с воронки, кладут в чашку, в которой кипятили смесь, заливают 200 мл 96% спирта и осторожно в водяной или песочной бане доводят до кипения. С фильтра остатки краски соскабливают в спирт, а фильтр выбрасывают. Спиртовой раствор краски охлаждают, фильтруют, доливают до 200 мл 96% спиртом и прибавляют 4 мл концентрированной хлороводородной кислоты (плотность 1, 16— 1, 19). Раствор хранится 1, 5—2 мес.

2. Раствор литиевого кармина Орта. К 100 мл насыщенного раствора карбоната лития (при 20°С это 1, 52% раствор) добавляют 2, 5 г кармина, кипятят 5—1О мин, охлаждают и фильтруют.

Методика окрашивания

1) срезы (замороженные, целлоидиновые или депарафинированные парафиновые) окрашивают в литиевом кармине 10—15 мин;

2) не ополаскивая срезов, переносят их в 1% раствор хлористоводородной кислоты на 70% спирте на 5—10 мин и более. Этот раствор фиксирует кармин в ядрах и одновременно дифференцирует, извлекая его из других структур;

3) промывают срезы в водопроводной воде и 70% спирте;

4) переносят в резорцин - фуксин на 20-30 мил;

5) ополаскивают в дистиллированной воде 1-2 мин;

6) дифференцируют в 1% спиртовом растворе хлористоводородной кислоты (или в чистом 96%) под контролем микроскопа до тех пор, пока не выступит отчетливо эластическая сеть (примерно 3-5 мин); 6) обезвоживают, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

Результат: ядра клеток красные, эластические волокна темно-синие.

Окрашивание эластических волокон резорцин - фуксином можно сочетать с окрашиванием по методу Ван-Гизона для чего срезы сначала окрашивают резорцин-фуксином, ополаскивают в воде, дифференцируют спиртовым раствором хлористоводородной кислоты и переносят в воду, а затем окрашивают по Ван-Гизону.

Выявление тучных клеток 0, 1% раствором толуидинового синего в 30% спирте 1-2 мин.

Краситель хорошего качества при этом дает красивую красно-фиолетовую окраску тучных клеток. Можно растворять толуидиновый синий в воде или в буферных растворах при низких значениях рН

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МЫШЕЧНЫХ ТКАНЕЙ

Окрашявание железным гематоксилином по Гейденгайну.

Сначала производят окрашивание железным гематоксилином по Гейденгайну, затем срезы скелетной или сердечной мышечной ткани можно докрасить 0, 5% водным раствором тиазинового красного, далее осуществляются их ополаскивание дистиллированной водой, обезвоживание, заключение в ксилол, бальзам.

Результат окрашивания: миофибриллы темно-синие, соединительная ткань и сарколемма интенсивно-красные, вставочные диски и хроматин черные.

Изоляция гладких миоцитов.

Маленькие кусочки гладкой мышечной ткани помещают в 33% раствор КОН. Через 1-2 ч в этом же растворе их разделяют препаровальными иглами на мелкие фрагменты. При удачной мацерации эти фрагменты распадаются на отдельные веретеновидные клетки уже от давления покровного стекла.

Окрашивание гладкой мышечной ткани на срезах ализариновым синим по Нейберту.

Приготовление растворов.

1. Раствор ализаринового синего: к 100 мл дистиллированной воды прибавляют 10 г химически чистого сульфата алюминия и 0, 5 г кислотного ализаринового синего, кипятят 5—10 мин, затем доливают до 100 мл дистиллированной водой и фильтруют.

2. Водный раствор ацетата меди (2, 5% или иной — концентрацию раствора и время пребывания в нем подбирают опытным путем).

3. 5% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Методика окрашивания:

1) срезы из дистиллированной воды переносят на 3-5 мин в раствор ализаринового синего, который в зависимости от плотности препарата в большей или меньшей степени разводят дистиллированной водой;

2) дифференцируют и протравливают срезы в 5% фосфорно-вольфрамовой кислоте;

3) ополаскивают в дистиллированной воде;

4) помещают на 5-30 мин в раствор ацетата меди (в зависимости от концентрации раствора и толщины срезов;

4) промывают в водопроводной воде;

5) обезвоживают, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам.

Результат: гладкая мышечная ткань окрашивается в синий цвет.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ И СЕРДЦА

Комбинированный метод окраски, рекомендованный Ромейсом.

Приготовление растворов.

Раствор резорцин - фуксина.

Раствор А: 0, 5 г основного фуксина и 1 г резорцина растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор Б: 2 г кристаллического хлорида железа растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Раствор А нагревают до кипения в колбе объемом 200 мл, прибавляют раствор Б и на малом пламени кипятят еще 5 мин при помешивании. После охлаждения до комнатной температуры осадок собирают на маленький фильтр, затем вместе с фильтром помещают в колбу, заливают 70—100 мл 96% спирта и доводят до кипения. При этом осадок переходит в раствор. Остудив, прибавляют 0, 7 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и фильтруют. Раствор годен в течение нескольких месяцев.

⇐ Предыдущая 12