Биологические методы исследования

⇐ ПредыдущаяСтр 17 из 59Следующая ⇒

Биологическими называют методы исследования, проводимые на лабораторных животных. Цель этих исследований: выделение микроорганизмов из исследуемого материала, особенно в тех случаях, когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева, например при вирусных заболеваниях, риккетсиозах и т. д.; выделение чистой культуры из материала, загрязненного другими микроорганизмами, не позволяющими искомому возбудителю размножаться на искусственной питательной среде; определение некоторых свойств выделенных микроорганизмов

(вирулентность и др.).

Экспериментальное заражение позволяет воспроизвести некоторые инфекционные болезни и решить ряд вопросов, касающихся инфекции и иммунитета, эффективности иммунобиологических препаратов, определения их реактивности и превентивных (предупредительных) свойств.

При выборе лабораторного животного необходимо учитывать степень его восприимчивости к изучаемой инфекции и установить, не вызывает ли у него данный возбудитель заболевания в естественных условиях.

Виды лабораторных животных

Для экспериментального заражения чаще всего используют белых мышей, крыс, морских свинок и кроликов. Для некоторых специальных исследований лабораторными животными служат обезьяны, кошки, собаки, лошади, мелкий и крупный рогатый скот, дикие животные (хомяки, суслики, дикие крысы, полевки), а также птицы (куры, голуби и т. д.).

В настоящее время часто пользуются чистолинейными (инбредными) животными, полученными при близкородственном скрещивании (братья, сестры) в течение 20-40 поколений с отбором животных по определенному признаку. Генетическая однородность мышей обеспечивает однообразие ответных реакций, поэтому в опыт можно брать меньшее количество животных.

Имеются специальные лаборатории, в которых ведутся исследования на безмикробных животных (их содержат в асептических условиях). Наука, изучающая безмикробную жизнь макроорганизмов, называется гнотобиологией. Одна из целей исследования - выявить роль нормальной и измененной микрофлоры в физиологических и патологических процессах макроорганизма.

Содержание лабораторных животных

Животные, используемые для биологического эксперимента, содержатся в специальных условиях. Для этого существуют особые помещения - виварии. В виварии лабораторных животных содержат в клетках или банках, установленных на стеллажах. Каждый вид лабораторных животных содержат отдельно. Помещение вивария должно быть теплым, светлым и сухим. Разводят животных в специальных питомниках в условиях, приближенных к естественным. Поступающих из питомника животных предварительно помещают в карантинное отделение.

Виварий должен иметь ряд специальных и подсобных отделений: карантинное, для содержания здоровых животных, помещение, предназначенное для вскрытий, и кухню (помещение для приготовления пищи).

В хорошо устроенном виварии должны быть два выхода - для изоляции части помещения в случае возникновения спонтанной, т. е. возникающей без искусственного заражения, инфекции.

Наблюдение за общим состоянием животных производится ежедневно. Все изменения состояния животных (вялость, отсутствие аппетита, наличие инфильтратов) или их гибель отмечают в специальном регистрационном журнале.

Уход за лабораторными животными и уборка помещения вивария. Для уборки вивария необходима специальная одежда: халат, фартук, резиновые перчатки, косынка и тапочки. При работе с животными, предназначенными для эксперимента с возбудителями опасных инфекций, дополнительно надевают клеенчатый фартук, резиновые сапоги, нарукавники, маску, очки.

Уборку начинают с осмотра клеток и банок для выявления всех заболевших и погибших животных. Затем вынимают поилки и кормушки, очищают их от остатков пищи, тщательно моют, а стеклянные кипятят. После этого специальными металлическими скребками очищают клетку от мусора и устанавливают поилки и кормушки на место. Раз в неделю клетки и банки нужно промывать горячей водой, дезинфицировать или автоклавировать. После очистки клеток приступают к уборке помещения.

По окончании уборки весь собранный мусор сжигают в печи. Павших животных вскрывают и тоже сжигают под контролем ответственного за это лица (врач или лаборант). Работники вивария тщательно дезинфицируют и моют руки.

Кормление животных. Правильное и полноценное кормление животных имеет очень большое значение. Разработаны нормы рационального питания для каждого вида животных, которые утверждены Министерством здравоохранения СССР. В эти нормы входят зерновые смеси, корнеплоды, сено, отруби, овощи, продукты животного происхождения и т. д.

Количество и характер продуктов зависит от вида животных и цели опыта.

Плохое содержание и неправильное питание животных приводят к снижению их устойчивости к инфекции, что сказывается на результатах опытов.

Отбор животных и подготовка их к опыту

Каждый вид животных лучше получать из одного питомника. Для опыта отбирают животных определенной породы, одинаковой массы, что приблизительно соответствует одному и тому же возрасту, и одного пола.

Отобранных животных рассаживают в чистые клетки или банки. На дно клетки кладут сено или опилки. Мелких животных, например белых мышей, можно сажать по 5-8 штук. Переносят животных в лабораторию в клетках или банках.

Перед опытом животных взвешивают. Для взвешивания удобнее пользоваться десятичными (без гирь) или тарированными весами.

Для проведения некоторых опытов животных ежедневно термометрируют. Измерение температуры производят специальным ртутным термометром, который перед употреблением дезинфицируют, насухо вытирают и смазывают вазелином. После употребления термометр вновь дезинфицируют. Термометр вставляют в просвет прямой кишки, причем глубина введения для каждого вида животных должна быть всегда одинакова, например для морской свинки - 3, 5 см. С этой целью на стеклянный столбик выше резервуара надевают ограничитель - колечко. Измерение температуры производят в течение 5 мин. Результаты регистрируют в специальном журнале.

Маркировка животных. Каждое животное, взятое в опыт, маркируется. Вид маркировки зависит от вида животного. Например, белых крыс и мышей метят красками: насыщенным спиртовым раствором фуксина, пикриновой кислоты, генциановым фиолетовым, перманганатом калия, хризоидином и др. Окрашивают разные части тела: голову, спину, переднюю правую лапку, заднюю левую лапку и т. д. Места окраски означают условные номера животных, например окраска передней правой лапки - № 3. Используя сочетание цвета и места окраски, можно пометить несколько сот животных.

Для маркировки кроликов и морских свинок используют металлические пластинки, на которых выгравирован номер. Эти пластинки имеют расширенную центральную часть и два отходящих, в стороны шипа. Перед употреблением пластинки погружают на 2-3 ч в спирт. Ухо подопытного животного протирают спиртом, эфиром и только после этого шипы продевают в уши животного, выводят на внутреннюю поверхность уха и загибают (рис. 27). Птицам (курам и голубям) обычно на правую лапку надевают алюминиевое кольцо, на котором проставлен номер.

Рис. 27. Пластинка с номером для метки лабораторных животных

Экспериментальное заражение животных

Иммобилизация животных. Перед опытом животное нужно вынуть из клетки. Чтобы животное не укусило и не поцарапало экспериментатора, существуют различные приемы: мышей и крыс берут за конец хвоста, кроликов и морских свинок - за кожу спины.

Затем животное фиксируют, т. е. ограничивают его подвижность, и создают наиболее удобное положение для проведения манипуляции.

Для фиксирования животных существуют разные приспособления: доски различного типа, ящики-боксы, пластинки, станки и т. д.

Вид фиксации зависит от характера манипуляции. Например, при введении материала в вену уха кролика можно использовать деревянный ящик-бокс, передняя стенка которого имеет отверстие для головы и состоит из двух половинок, одна из которых выдвигается. Животное помещают в ящик, голову просовывают в отверстие и фиксируют выдвижной половиной стенки (рис. 28). Чтобы фиксировать животное в лежачем положении, используют доску, которая должна соответствовать размеру тела животного. Сбоку доски на уровне лапок укрепляют четыре кольца или крючка. Животное кладут животом вверх или вниз в зависимости от характера манипуляции, на лапки надевают петли, сделанные из марлевого бинта или веревки, другой конец которой закрепляют на крючке или в кольце.

Рис. 28. Бокс для фиксации головы кролика

Применяют и более простые формы иммобилизации: животное можно плотно запеленать в полотенце или халат либо держать в положении, ограничивающем движения. Например, помощник берет морскую свинку правой рукой за задние лапки, левой - за грудь. Белую мышь можно взять за кончик хвоста, поместить на стол и, когда хвост при движении животного натягивается, левой рукой захватить кожу головы или затылка между ушами. Крыс фиксируют так же, но при этом обычно применяя корнцанги.

Работать с мелкими животными, например с мышами, можно и одному, без помощника: для этого надо захватить указательным и большим пальцами левой руки кожу затылка мыши между ушами и, повернув руку ладонью вверх, зажать левую лапку и хвост между мизинцем и мягкой частью ладони.

Свободной рукой производят нужные манипуляции (рис. 29).

Рис. 29. Фиксация мыши без помощника

Подготовка инструментов для проведения эксперимента. Шприцы, иглы, пинцеты, скальпели, предназначенные для заражения животных, стерилизуют кипячением. Шприцы предварительно разбирают, закладывают в сетку стерилизатора, кипятят 30 мин, затем стерильно собирают при помощи пинцета.

Животное можно заражать нативным материалом: гноем, мокротой, кровью, эмульсией из органов и т. д. и взвесью микробов, густоту которой определяют с помощью оптического стандарта.

Материал, предназначенный для инъекции, помещают в стерильную посуду. Чтобы избежать разбрызгивания исследуемого материала, наполнение шприца производят крайне осторожно. Для этого отверстие иглы опускают ниже поверхности материала и осторожно, медленно набирают в цилиндр шприца количество материала несколько больше, чем требуется. Затем поворачивают шприц вертикально (иглой вверх) и, покрывая кончик иглы стерильной ватой, выталкивают из шприца пузырьки воздуха и избыток материала. Грязную вату сбрасывают пинцетом в дезинфицирующий раствор.

Контрольные вопросы

1. Что означает понятие " биологический метод"?

2. Что необходимо учитывать при выборе лабораторного животного?

3. Каких животных обычно используют для эксперимента?

4. Каким требованиям должно отвечать помещение вивария? Из каких отделений состоит виварий?

5. Как маркируют лабораторных животных?

6. Для чего фиксируют животных? Какие приспособления для этого существуют?

7. Как следует наполнять шприц, чтобы избежать разбрызгивания материала?

Задание

Простерилизуйте шприц. Соберите его. Наполните изотоническим раствором натрия хлорида, накройте кончик иглы ватой и вытолкните из шприца пузырьки воздуха и избыток материала (изотонический раствор натрия хлорида).

Способы заражения

Существуют следующие способы введения материала: подкожный, внутрикожный, накожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный (через рот), интраназальный (через нос в дыхательный тракт); введение в глаз, введение в центральную нервную систему и т. д.

Участок, где должна быть сделана инъекция, разрез или пункция, называют операционным полем. Чаще применяют подкожное введение материала. Для введения животным материала внутрикожно, подкожно или накожно необходимо освободить операционное поле от шерсти. Шерсть можно выстричь (для этого применяют ножницы с загруженными краями, чтобы избежать порезов), выщипать или удалить при помощи бритвы, растягивая для этого кожу большим и указательным пальцами левой руки (чтобы не поранить кожу).

В некоторых случаях для полного удаления шерсти применяют депиляторий^*, однако им можно пользоваться только за 2-3 дня до опыта, так как он иногда вызывает раздражение кожи. После применения депилятория кожу очищают от шерсти, промывают теплой водой и смазывают вазелином.

* (Состав депилятория: 7 частей талька, 7 частей белой муки, 1 часть мыльного порошка и 3 части сернистонатриевого сплава.)

При любом способе удаления шерсти перед инъекцией операционное поле дезинфицируют спиртом или спиртовым раствором йода.

Подкожное введение. Место введения выбирают в зависимости от вида животного. Кроликам материал обычно вводят под кожу спины, морским свинкам - под кожу живота или бока, мышам и крысам - под кожу спины или затылка.

Для подкожного введения кожу животного захватывают в складку, иглу вкалывают у основания образовавшейся складки, медленно вводят ее до половины, чуть отклоняя в сторону, чтобы не вылился вводимый материал, затем опускают складку, накладывают на иглу вату, смоченную спиртом или спиртовым раствором йода, и быстро извлекают иглу.

Внутрикожное введение. Этот способ наиболее часто применяют при алергических пробах и введении токсина (например, дифтерийного). Необходимо иметь тонкие, острые иглы (№ 18-20) с короткой бородкой. Удобно использовать туберкулиновый шприц. Кожу, освобожденную от шерсти, растягивают большим и указательным пальцами; иглу вводят под острым углом срезом вверх. Правильно введенная игла просвечивает сквозь эпидермис. Исследуемый материал вводят медленно; на месте введения образуется пузырек, который быстро рассасывается.

Накожный способ. Поверхность кожи после удаления шерсти скарифицируют^*. Исследуемый материал наносят а скарифицированный участок и втирают шпателем или стерильной палочкой. Животное должно быть зафиксировано до тех пор, пока нанесенный материал не просохнет.

* (Скарификацией называют повреждение поверхности кожи, которое производят любым остроконечным инструментом: скальпелем, иглой или специальным скарификатором.)

Внутримышечное введение. Материал вводят в толщу мышцы, чаще в мышцу бедр. Для этого удобно захватить мышцу указательным и большим пальцами левой руки; правой рукой под прямым углом вводят иглу.

Внутрибрюшинное введение. При этом способе введения животное следует держать вертикально головой вниз (для перемещения внутренних органов к диафрагме). Иглу вводят в нижнюю часть живота, чуть отступя от средней линии - такое положение уменьшает возможность ранения кишечника. Кроликам и морским свинкам предварительно делают небольшую надсечку верхнего слоя кожи. Применяют иглы с короткой бородкой, которые вводят под острым углом. После прокола кожи шприц переводят в горизонтальное положение и уже под прямым углом к брюшной стенке проталкивают иглу до ощущения " провала", затем ее вновь переводят в вертикальное положение и вводят исследуемый материал.

Внутривенное введение. При этом методе выбор вены зависит от вида животного: кроликам материал вводят в краевую вену уха, мышам и крысам - в вену хвоста, морским свинкам - непосредственно в сердце, так как их вены малодоступны для инъекций.

Для внутривенных инъекций используют иглы с длинной бородкой. Животные должны быть иммобилизованы. После фиксации животного для лучшего выявления вены кожу протирают ватой, смоченной ксилолом или теплой водой. Можно также пощелкать участок кожи, где расположена вена, кончиками пальцев и прижать вену у корня хвоста или уха - эти манипуляции способствуют набуханию вены. Затем экспериментатор левой рукой фиксирует место введения, шприцем, находящимся в правой руке, прокалывает кожу и под очень острым углом, почти параллельно вене, вводит иглу срезом вверх. Если игла не попала в вену, то при надавливании поршня ощущается затруднение и в месте введения появляется белый пузырек, образованный жидкостью, попавшей в ткань. В этом случае иглу извлекают и производят новый укол ближе к корню хвоста (если вводят в вену хвоста) или к основанию уха (если вводят в вену уха). При попадании иглы в вену жидкость свободно проходит в нее. После того как материал введен, иглу прижимают немного ниже места укола, накладывают на это место кусок стерильной ваты, после чего иглу извлекают. Место инъекции протирают спиртом или спиртовым раствором йода.

Морским свинкам исследуемый материал вводят в сердце. Для этого двумя пальцами левой руки прощупывают сердечный толчок и через межреберный промежуток вкалывают иглу в место толчка. При попадании иглы в сердце в шприце показывается кровь, и тогда вводят весь материал.

При инъекциях, особенно в ток крови (в вену, в сердце), вводимая жидкость должна быть свободна от пузырьков воздуха, которые могут вызвать газовую эмболию.

Введение через пищеварительный тракт. Существует несколько способов перорального (через рот) заряжения. Самый простой из них - это примешивание исследуемого материала к пище животного. Этот способ хорош тем, что близок к естественному, однако в этом случае трудно учесть количество вводимого материала. Второй способ - введение материала в желудок с помощью зонда, диаметр и длина которого зависят от вида животного. Вводить зонд следует после того, как в рот животного вставлен роторасширитель. Предварительно зонд смазывают вазелином. Когда введенный зонд достигает носоглотки, в рот вливают несколько капель воды и в момент глотания продвигают зонд. Правильно вставленный зонд должен продвигаться легко и свободно. После того как трубка достигнет желудка, через наружный ее конец шприцем без иглы вводят нужное количество исследуемого материала. Третий способ - закапывание шприцем с иглой. Для этого животное фиксируют в вертикальном положении, открывают рот пинцетом или надавливая двумя пальцами на щеки, и вводят исследуемый материал по каплям, причем каждую каплю вводят только после того, как животное проглотило предыдущую. Такое медленное введение необходимо для устранения возможности попадания жидкости в дыхательные пути. Наконец, исследуемый материал можно вводить в пищевод при помощи шприца с иглой, имеющей на конце оливу. Диаметр иглы должен быть 1 мм, длина зависит от вида животного: 30-40 мм для мышей, 70-80 мм для крыс и т. д.

При таком способе введения животное фиксируют также в вертикальном положении, открывают ему рот пинцетом и вводят иглу, ведя ее по задней стенке зева, затем переводят иглу в вертикальное положение и очень медленно вливают жидкость.

Введение через дыхательные пути. Интраназально (через нос) заражение проводят двумя различными способами. Наиболее простым способом является закапывание исследуемого материала через нос шприцем (чтобы не поранить слизистую оболочку, пользуются тупой иглой). Заражение осуществляют под легким эфирным наркозом; к носу прикладывают вату, смоченную эфиром, под действием которого животное начинает глубоко дышать, втягивая при этом вводимый материал.

Второй способ - закапывание исследуемого материала в ноздри пипеткой (по каплям); при этом способе животное фиксируют брюшком вверх.

Введение в глаз. Вводить материал можно несколькими способами. Производят заражение через конъюнктиву. Для этого, придерживая веко, пипеткой закапывают в глаз исследуемый материал (1-2 капли). Второй способ - субконъюнктивальный. Материал вводят тонкой иглой под конъюнктиву. Этим путем можно ввести 0, 1-0, 2 мл. Третий способ - введение материала в скарифицированную роговую оболочку; при этом способе животное необходимо фиксировать. Глаз прижимают пинцетом, роговую оболочку скарифицируют концом скальпеля или обычной иглой; в скарифицированную роговую оболочку тонким стеклянным шпателем или ватным тампоном втирают исследуемый материал. Этот способ применяют большей частью при опытах на кроликах и собаках, реже на морских свинках и других животных.

Контрольные вопросы

1. Что такое операционное поле и как его обрабатывают?

2. Какие способы заражения животных Вы знаете?

3. От чего зависит количество вводимого животному материала?

Задание

Нарисуйте схему маркировок белой мыши. Нанесите краску на схему так, чтобы номер животного соответствовал 3.

В табл. 12 приведены величины максимального количества вводимой жидкости в зависимости от вида животных и способа введения.

Таблица 12. Схема введения инфицированного материала животным Вскрытие и микробиологическое исследование погибших животных

При экспериментальном заражении вскрытие животного после его гибели, характер изменений и результат бактериологического исследования внутренних органов позволяют выяснить причину смерти животного, пути распространения возбудителей в организме и место их локализации. В некоторых случаях животных приходится умерщвлять на определенных этапах эксперимента. Существует несколько способов умерщвления. Наиболее часто применяют следующий: животное помещают в банку или плотно закрывающийся сосуд, в который опускают кусок ваты, смоченный эфиром или хлороформом. Гибель животного наступает через несколько минут. Одним из способов умерщвления мелких животных, например мышей, является декапитация (мышам срезают голову). Для умерщвления кроликов используют воздушную эмболию: вводят иглу в вену, соединяют ее со шприцем без жидкости и, нажимая на поршень, вводят воздух в вену; животное погибает мгновенно.

Вскрытие следует производить непосредственно после гибели животного, чтобы избежать проникновения микроорганизмов из кишечника в кровь и другие органы. При отсутствии такой возможности трупы сохраняют на холоду.

Вскрытие производят на специальном столе, в отдельной комнате, если такая имеется.

На столе должно находиться все необходимое для вскрытия, бактериологического исследования патолого-анатомического материала: доска или кювета, залитая парафином, для фиксации животного; газовая горелка или спиртовка; сосуд со спиртом и ватой на дне, в котором находятся простерилизованные инструменты (ножницы, скальпель, хирургический и анатомический пинцеты и др.); стерильные ватные тампоны, бактериальная петля, стерильные пастеровские пипетки, предметные стекла, чашки Петри, пробирки с питательными средами. Выбор сред зависит от вида микроорганизмов, которых считают причиной гибели животного.

Все наблюдения, сделанные во время вскрытия, протоколируют. Отмечают вид животного, номер, время и место заражения, материал, примененный для заражения, время гибели, обнаруженные изменения и т. д.

Во время вскрытия надо следить за тем, чтобы жидкость и кусочки тканей и органов не попали на стол. После каждой манипуляции инструменты промывают водой или спиртом и прожигают. Сделанные посевы надписывают. Мазки фиксируют в пламени горелки или в специальной фиксирующей жидкости (например, в смеси Никифорова).

Вскрытие состоит из следующих этапов: 1) фиксация животного; 2) осмотр наружных покровов; 3) вскрытие и исследование грудной полости; 4) вскрытие и исследование брюшной полости.

Фиксация. Животных укладывают брюшком вверх. Кроликов и морских свинок привязывают за лапки к находящимся в углах доски крючкам или кольцам. Мышам и крысам лапки можно приколоть кнопками или иглами. Лапки при этом широко раздвигают.

Осмотр наружных покровов. Ватой, смоченной дезинфицирующим раствором, протирают всю поверхность тела. Осматривают наружные покровы и делают разрез кожи по средней линии, начиная от лобка до нижней челюсти, стараясь не повредить при этом боковые надрезы. Инструменты, использованные для вскрытия кожи, протирают, обжигают или меняют и только тогда продолжают вскрытие. Пинцетом захватывают край кожного лоскута и скальпелем отсепаровывают его от подкожной клетчатки. Отмечают состояние паховых и подмышечных лимфатических узлов, подкожной клетчатки, расширение сосудов, кровоизлияние, нагноения и т. д.

При обнаружении изменения лимфатических узлов (припухания, отека, нагноения) делают мазки и посев их содержимого на специальные среды.

Для вскрытия грудной полости захватывают пинцетом мечевидный отросток, под ним делают разрез, в который вставляют ножницы, и перерезают с обеих сторон ребра в месте соединения их с хрящами грудной кости. Грудину отбрасывают вверх и осматривают грудную полость. При осмотре легких и сердца отмечают их цвет, величину, консистенцию. При наличии изменений производят посев и делают мазки из измененной части легкого. Далее срезают кусочек легкого и опускают его в баночку или пробирку с водой. Здоровое легкое всплывает на поверхность, больное тонет. Обязательно делают посев крови из сердца. Для этого придерживают сердце пинцетом у его основания, прижигают раскаленным скальпелем верхушку сердца и стерильной пастеровской пипеткой прокалывают прожженный участок, кровь при этом поднимается в капилляр. Набранную кровь выдувают по каплям в питательные среды и делают из нее мазки.

При вскрытии брюшной полости пинцетом приподнимают кожу брюшной стенки, ножницами делают разрез от лобка до диафрагмы, затем делают два боковых надреза - у лобка и диафрагмы, широко открывая этим брюшную полость. Осматривают все органы брюшной полости, из измененных органов делают посев на питательные среды, мазки и мазки-отпечатки. При отсутствии внешних изменений обязательно производят посев и делают мазки из селезенки, печени и мезентериальных узлов. Для посева прижженную поверхность органа надрезают стерильным скальпелем, из глубины органа вырезают кусочек, часть его опускают в питательную среду, из другой части делают мазки-отпечатки, прикладывая срезанную часть к стеклу, и мазки. Отпечатки всех органов можно сделать на одном стекле, соблюдая определенную последовательность в их расположении. Этот метод принят при эксперименте на животных, зараженных возбудителями особо опасных инфекций. Зная последовательность расположения отпечатков различных органов, можно не надписывать каждый отпечаток (рис. 30).

Рис. 30. Приготовление мазков-отпечатков органов и мазка крови на одном стекле. 1 - лимфатические узлы; 2 - легкое; 3 - селезенка; 4 - печень; 5 - мазок крови

После окончания вскрытия производят тщательную уборку рабочего места. Труп животного укладывают в банку или специальный сосуд (например, ведро) и под контролем ответственного лица сжигают или автоклавируют. Если нельзя уничтожить труп сразу после вскрытия, его заливают дезинфицирующим раствором (5% карболовая кислота или 5% лизол). Доску или кювету протирают спиртом и прожигают или заливают на сутки дезинфицирующим раствором. Инструменты осторожно с помощью чистого пинцета укладывают в стерилизатор и кипятят 30-40 мин. После работы с патогенными спорообразующими бактериями инструменты автоклавируют. Посевы помещают в термостат.

Зафиксированные мазки окрашивают и изучают.

Контрольные вопросы

1. С какой целью проводят вскрытие лабораторных животных?

2. Из каких этапов состоит вскрытие лабораторных животных?

3. Как готовят мазки и мазки-отпечатки из органов и тканей? Какие правила надо соблюдать при приготовлении отпечатков на одном предметном стекле? 4. Как дезинфицируют оборудование и инструменты в ходе и по окончании вскрытия?

В микробиологической практике животных используют также в качестве доноров. Кровь животных применяют как в цельном виде, так и для получения ее отдельных составных частей (сыворотка, плазма, эритроциты и т. д.). Кровь и сыворотка крови могут быть использованы как ингредиенты сред, а также для изучения иммунных свойств после вакцинации.

Чаще используют кровь кролика, морских свинок, реже - крыс и мышей, из крупных животных - кровь лошадей, баранов, быков.

Способ получения крови зависит от вида животного и цели исследования.

Техника взятия крови у животных

У кролика небольшое количество крови берут обычно из краевой вены уха, у крыс и мышей - из вены хвоста, у морских свинок ввиду плохо развитых поверхностных вен - непосредственно из сердца. Кровь из сердца можно брать и у других лабораторных животных.

В случае, когда донорами являются крупные животные (лошади, бараны), кровь берут из яремной вены.

Для взятия небольшого количества крови у кролика выщипывают шерсть с наружной поверхности уха, дезинфицируют кожу и вызывают гиперемию, пощелкивая по вене пальцами или протирая ухо ватой, смоченной теплой водой (применять ксилол не следует, так как он может вызвать лизис - растворение эритроцитов).

Кроме того, можно прижать вену у корня уха, что также способствует гиперемии. Затем экспериментатор большим и указательным пальцами захватывает кончик уха (фиксируя его) и вводит иглу без шприца по ходу вены. Капающую из иглы кровь собирают в стерильную пробирку, после чего иглу извлекают, место укола дезинфицируют спиртом или спиртовым раствором йода.

При взятии крови из вены хвоста у мышей и крыс ампутируют кончик хвоста. Вытекающую из культи кровь собирают в стерильную пробирку или насасывают пипеткой. Для остановки кровотечения культю прижигают перекисью водорода или в пламени горелки.

При взятии крови из сердца животное фиксируют в горизонтальном положении брюшком вверх, удаляют шерсть, дезинфицируют место укола, затем кончиками пальцев левой руки прощупывают сердечный толчок и в этом месте вводят иглу. Если игла попала в сердце, кровь сама поступает в шприц, подымая поршень. Количество взятой крови зависит от вида животного и его массы (табл. 13).

Таблица 13. Максимальное количество крови, получаемой от лабораторных животных

После одномоментного кровопускания животному следует ввести под кожу изотонический раствор натрия хлорида, подогретый до температуры тела, в объеме, равном объему взятой крови.

При необходимости получить максимальное количество крови производят тотальное кровопускание (полное обескровливание). При тотальном кровопускании кровь чаще всего берут из сонной артерии. Животное фиксируют в горизонтальном положении брюшком вверх, наркотизируют, поднося к носу смоченную эфиром вату, и после обработки операционного поля делают разрез кожи на шее. Обнажают сонную артерию, отсепаровывают ее, накладывают две шелковые лигатуры и перерезают между ними артерию. Периферический конец артерии быстро пережимают, а центральный захватывают пинцетом и опускают в стерильный сосуд. Когда струя крови иссякнет, можно дополнительно собрать кровь, массируя область сердца, печень и другие органы. Недостатком тотального кровопускания является гибель животного.

Обработка и выделение составных частей крови

Получение дефибринированной крови. Кровь помещают в стерильную колбу или баночку со стеклянными бусами и энергично встряхивают в течение 15-20 мин; при этом фибрин оседает на бусах в виде сгустка. Свободную от фибрина кровь переливают в стерильную посуду.

Получение цитратной крови. К крови добавляют вещество, предотвращающее ее свертывание, - 5% раствор натрия цитрата в соотношении 1: 10 (на 10 мл крови 1 мл 5% раствора натрия цитрата).

Получение плазмы. Жидкую часть крови получают из цитратной крови, которую центрифугируют или ставят в холодильник на 18-20 ч. В результате над осадком образуется слой жидкости желтоватого цвета - плазма.

Получение сыворотки крови (см. главу 12).

Получение взвеси эритроцитов. Взвесь эритроцитов получают из цельной и дефибринированной крови.

Кровь центрифугируют в течение 15-20 мин при 2000-3000 об/мин. Эритроциты оседают на дно, образовавшуюся над ними желтовато-красную жидкость сливают, а в пробирки добавляют стерильный изотонический раствор натрия хлорида до первоначального объема и вновь центрифугируют. Такое промывание эритроцитов производят 2-3 раза, пока надосадочная жидкость не станет совершенно бесцветной. Последнюю порцию надосадочной жидкости удаляют, а в пробирке остается взвесь эритроцитов, которую можно использовать в течение 2-3 дней. Для сохранения эритроцитов в течение более длительного срока их подвергают обработке формалином. Для получения 50% взвеси к одному объему эритроцитов добавляют два объема буферного раствора, имеющего рН 7, 2, и при постоянном помешивании такое же количество 3% раствора формалина. Полученную смесь выдерживают на водяной бане при 37° С 2-3 ч, помешивая ее каждые 15-20 мин, а затем в термостате (всего 20 ч при 37° С). На следующий день смесь центрифугируют в том же растворе, сливают надосадочную жидкость, а осадок доводят до первоначального объема буферным раствором, разливают по флаконам, плотно закрывают и хранят при 4° С.

Контрольные вопросы

1. Какова техника взятия крови у кроликов, морских свинок, крыс, мышей и какие из них чаще служат донорами?

2. Что такое тотальное кровопускание?

3. Какие максимальные количества крови можно получить от лабораторных животных при одномоментном и тотальном кровопускании?

4. Как получить нитратную и дефибринированную кровь и составные части крови: плазму, сыворотку, взвесь эритроцитов?

Задание

Возьмите пробирку с кровью и получите из нее сыворотку.

⇐ Предыдущая 12 13 14 15 161718 19 20 21 Следующая ⇒