Кафедра технологии продуктов питания и экспертизы товаров

МИНЕСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

Кафедра технологии продуктов питания и экспертизы товаров

 

Общ.пит.-30.11.2701.очн. Общ.пит.-30.11.2705.очн. Общ.пит.-30.11.2710.очн.

Общ.пит.-30.11.2701.вчр.плн. Общ.пит.-30.11.2705.вчр.плн. Общ.пит.-30.11.2710.вчр.плн.

Общ.пит.-30.11.2701.вчр.скр. Общ.пит.-30.11.2705.вчр.скр. Общ.пит.-30.11.2710.вчр.скр.

Общ.пит.-30.11.2701.зчн.плн. Общ.пит.-30.11.2705.зчн.плн. Общ.пит.-30.11.2710.зчн.плн.

Общ.пит.-30.11.2701.зчн.скр. Общ.пит.-30.11.2705.зчн.скр. Общ.пит.-30.11.2710.зчн.скр.

Общ.пит.-30.11.2703.очн. Общ.пит.-30.11.2707.очн. Общ.пит.-30.11.2712.очн.

Общ.пит.-30.11.2703.вчр.плн. Общ.пит.-30.11.2707.вчр.плн. Общ.пит.-30.11.2712.вчр.плн.

Общ.пит.-30.11.2703.вчр.скр. Общ.пит.-30.11.2707.вчр.скр. Общ.пит.-30.11.2712.вчр.скр.

Общ.пит.-30.11.2703.зчн.плн. Общ.пит.-30.11.2707.зчн.плн. Общ.пит.-30.11.2712.зчн.плн.

Общ.пит.-30.11.2703.зчн.скр. Общ.пит.-30.11.2707.зчн.скр. Общ.пит.-30.11.2712.зчн.скр.

Общ.пит.-30.11.2704.очн. Общ.пит.-30.11.2708.очн. Общ.пит.-30.11.3511.очн.

Общ.пит.-30.11.2704.вчр.плн. Общ.пит.-30.11.2708.вчр.плн. Общ.пит.-30.11.3511.вчр.плн.

Общ.пит.-30.11.2704.вчр.скр. Общ.пит.-30.11.2708.вчр.скр. Общ.пит.-30.11.3511.вчр.скр.

Общ.пит.-30.11.2704.зчн.плн. Общ.пит.-30.11.2708.зчн.плн. Общ.пит.-30.11.3511.зчн.плн.

Общ.пит.-30.11.2704.зчн.скр. Общ.пит.-30.11.2708.зчн.скр. Общ.пит.-30.11.3511.зчн.скр.

 

Авторы: Е.И. Кострова, Е.В. Журавко.

 

Лабораторный практикум по

МИКРОБИОЛОГИИ

для студентов специальностей:

 

2701 – Технология хранения и переработка зерна

2703 – Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий

2704 – Технология сахаристых продуктов

2705 – Технология бродильных производств и виноделия

2707 – Технология жиров и эфирных масел

2708 – Технология консервов и пищеконцентратов

2710 – Технология рыбы и рыбных продуктов

2712 – Технология продуктов общественного питания

3511 – Товароведение и экспертиза товаров

всех форм обучения

 

 

Москва 2003 г.

Содержание

Введение

Работа 1. Микроскоп и техника микроскопирования микроорганизмов……5

Устройство оптического микроскопа МБИ………….……………..6

Техника микроскопирования………………………………….…….9

Правила обращения с микроскопом……………….……………….10

Задание……………………………………………………………….11

Работа 2. Морфология бактерий и техника их микроскопирования………...11

Приготовление фиксированных препаратов бактерий……………13

Прижизненное наблюдение.………………………………………...14

Окрашивание препаратов и приготовление красителей……...…...15

Окраска по Граму…………………………………………………….16

Задание 1, 2, 3………………………………………………………….18

Работа 3. Морфология дрожжей и их микроскопирование.………………….18

Задание 1, 2……………………………………………………………20

Работа 4. Изучение морфология основных видов мицелиальных грибов,

имеющих значение в пищевой промышленности…………….……21

Приемы техники микроскопирования мицелиальных грибов…….26

Задание 1, 2…………………………………………………………….28

Работа 5. Приготовление и способы стерилизации питательны сред, воды

и посуды, используемых в микробиологической практике.……….28

Способы и режимы стерилизации питательных сред,

воды и посуды..………………………………………………..…..….31

Задание.……………………………………………………………..…34

Работа 6. Методы количественного учета и анализа состава микрофлоры

разных видов пищевого сырья, полуфабрикатов и готовой

продукции……………………………...……………………………...34

Работа 7. Особенности состава микрофлоры и методов ее определения и

контроля в некоторых основных видах пищевого сырья и

получаемых из него продуктов………………………………………39

Микрофлора зерна и муки и методы ее определения ……………...39

Задание.………………………………………………………………..41

Микрофлора молока, молочных продуктов и методы

ее определения.………………………………………………………..41

Задание………………………………………………………………...45

Микрофлора сливочного масла и маргарина………………………..46

Задание………………………………………………………………...47

Микрофлора мяса и методы ее определения…………………….….47

Задание………………………………………………………………...49

Микрофлора рыбы и рыбных продуктов……………………………49

Задание………………………………………………………………...52

Микрофлора сахара и методы ее определения……………………..52

Задание………………………………………………………………..52

Микрофлора солода и ее определение……………………………...53

Задание………………………………………………………………..54

Микрофлора свежих плодов и овощей……………………………..54

Задание……………………………………………………………..…59

Микрофлора квашенных овощей……………………………………59

Задание……………………………………………………………..…60

Микрофлора баночных консервов и методы ее определения….….60

Задание………………………………………………………………..64

Работа 8. Методы учета и анализа микрофлоры воды, воздуха,

оборудования и других объектов, связанных с производством пищевых продуктов…………………………………………………..65

Микробиологическое исследование воды…………………………..65

Задание………………………………………………………………...67

Исследование микрофлоры воздуха…………………………………67

Задание………………………………………………………………...69

Санитарно-бактериологическое исследование оборудования,

инвентаря, рук работающих и других объектов, связанных с

производством пищевой продукции………………………………...69

Задание………………………………………………………………...70

Работа 9. Превращение микроорганизмами безазотистых и

азотосодержащих органических веществ (процессы брожения

и гниения)……………………………………………………………..70

Спиртовое брожение…………………………………………………70

Маслянокислое брожение……………………………………………72

Аммонификация или гниение белковых веществ………………….73

Приложение – питательные среды………………………………….74

Литература……………………………………………………………76

 

ВВЕДЕНИЕ

Настоящий практикум по технической микробиологии предназначен для студентов дневной, вечерней и заочной формы обучения по специальностям 2701, 2703, 2704, 2705, 2707, 2708, 2710, 2712 и 3511(Хранение и технология переработки зерна, технология хлебопекарного, кондитерского и макаронного производства, технология сахаристых веществ, технология виноделия и пивоварения, технология производства жиров, технология консервирования, технология рыбных продуктов, технология продуктов общественного питания, товароведения и экспертизы товаров).

Практикум имеет целью ознакомить студентов с морфологией и методами микроскопирования бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, основами приготовления и способами стерилизации питательных сред и других предметов, используемых в микробиологической практике. Практикум дает представление о методах посева и учета микроорганизмов в сырье, пищевых продуктах, воде, воздухе и других объектах, связанных с производством пищевой продукции.

В целом практикум имеет своей целью помочь самостоятельной работе студентов и облегчить им изучение теоретического и практического курса технической микробиологии.

Работа 1. МИКРОСКОП И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Для изучения морфологических признаков разных групп микроорганизмов в производственных лабораторных исследованиях пользуются оптическим микроскопом. Современными моделями биологического микроскопа являются микроскопы серии «Биолам».

Микроскопирование является обязательным приемом при повседневном санитарно-бактериологическом контроле на предприятиях, связанных с производством и хранением пищевых продуктов, а также веществ и препаратов микробиологического синтеза (ферментов, витаминов и др.). Микроскопированием определяют чистоту культур промышленных микроорганизмов, изменения их количественного и качественного (группового или видового) состава по ходу процесса производства.

При помощи микроскопирования выявляют постороннюю микрофлору в сырье, полуфабрикатах, готовой продукции, на технологическом оборудовании, мешающую нормальному ходу процесса производства. Выявление нежелательной микрофлоры является сигналом для своевременной санитарной обработки оборудования и других объектов, связанных с производством продуктов питания и продуктов микробного синтеза. Учитывая, что микроскоп служит важнейшим орудием контроля в пищевой промышленности – знакомство с устройством оптического микроскопа и техникой микроскопирования является одним из основных практических навыков, которым должны овладеть студенты в курсе лабораторных занятий по микробиологии. Первые научные описания микроорганизмов принадлежат голландскому исследователю Антонию Левенгуку (1632-1727). Он применил для исследования простой микроскоп, представлявший собой лупу, которая давала увеличение до 300 раз.

Английский физик и изобретатель Роберт Гук сконструировал в 1660 г. микроскоп, состоявший из двух линз: объективной и окулярной. В XVII в. русский академик Л. Эйлер разработал теоретические основы расчетов ахроматических объективов, свободных от хроматической и сферической аберраций, и в 1774 г. был изготовлен такой микроскоп. В 1827 году итальянский ученый Дон Амичи применил иммерсионный объектив. Работы немецкого физика Э. Аббе (1872) послужили основой для дальнейшего усовершенствования объективов и осветительных систем.

Таким образом, современный оптический микроскоп был сконструирован только в конце XIX века.

Устройство оптического микроскопа МБИ-1 (Рис.1)

Биологический микроскоп (от греческих слов micros - малый, scopeo-смотрю) состоит из трех основных частей: механической, осветительной и оптической.

Механическая часть микроскопа включает штатив, тубус, револьвер, винты с зубчаткой для передвижения тубуса и осветительного аппарата и предметный столик.

Штатив состоит из 2-х частей - нижней ножки или подставки, дающей микроскопу устойчивость, и верхней - тубусодержателя, имеющей форму ручки, за которую держат микроскоп при переносе.

Тубус – зрительная труба микроскопа. Для удобства работы биологический микроскоп МБИ-1 имеет наклонное положение тубуса, что достигается при помощи призмы, которая находится между объективом и окуляром. Наклонный тубус позволяет проводить исследования сидя, причем предметный столик микроскопа всегда расположен горизонтально, что особенно удобно при рассматривании жидких препаратов и при работе с иммерсией.

В верхнюю часть тубуса вставляют сменные окуляры. К нижней части тубуса привинчен так называемый револьверный механизм.

Револьвер состоит из 2-х выпуклых пластинок: верхняя из них наглухо привинчена к тубусу, а нижняя может вращаться вокруг своей оси. Нижняя пластинка имеет гнезда (3 или 4), в которые ввинчиваются объективы.

При вращении этой пластинки любой из объективов может быть подведен под тубус; маленькая пружинка, защелкиваясь в свой паз, удерживает объектив в этом положении.

При установлении объектива на фокус тубус перемещается вдоль оптической оси микроскопа с помощью двух винтов.

Один из них – кремальер а или макрометрический винт служит для грубой наводки. При малом увеличении микроскопа пользуются только макрометрическим винтом. Другой винт дает очень небольшие перемещения тубуса и называется микрометрическим. Этот винт служит для точной установки объектива на фокус при использовании большого увеличения (объективы 40х и 90х). Полный поворот микрометрического винта перемещает тубус лишь на 0, 1 мм, а так как барабан винта разделен на 50 делений, то поворот на одно деление перемещает тубус на 0, 002 мм или 2 мкм/1 микрометр – 1/1000 мм/.

 

 

 

Рис. 1. Микроскоп:

1-объектив, 2- окуляр, 3- осветительное устройство, 4- тубус,

5- предметный столик, 6- макрометрический винт, 7- микрометрический винт

 

При вращении винтов по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, а при вращении против часовой стрелки – поднимается вверх.

Микрометрический винт является одной из наиболее хрупких частей микроскопа, поэтому обращаться с ним нужно чрезвычайно осторожно.

Предметный столик микроскопа имеет круглую форму, прикреплен к штативу. В центре его имеется отверстие для прохождения лучей света, освещающих препарат при исследовании. На столике имеются 2 металлических зажима (клеммы), которые служат для закрепления препарата при микроскопировании. Столик перемещается в двух взаимно перпендикулярных направлениях при помощи 2-х винтов, находящихся справа и слева, что позволяет рассматривать препарат последовательно в разных местах.

Осветительная часть микроскопа представлена конденсором Аббе, который состоит из нескольких линз, закрепленных в оправу и передвигающееся вверх и вниз при помощи винта. С помощью конденсора лучи, отраженные от источника света (зеркало или светильник) направляются через систему линз в объектив микроскопа и освещают исследуемый препарат.

При поднятии и опускании конденсора изменяется угол преломления лучей, вследствие чего изменяется степень освещенности препарата. Чем ниже положение конденсора, тем меньше освещение препарата и наоборот. При работе с иммерсионными объективами(90х) конденсор обычно поднимают до уровня предметного стекла, при работе с малыми и средними объективами конденсор несколько опускают.

На нижней поверхности конденсора укреплена ирис-диафрагма. Она состоит из нескольких металлических пластинок, произвольно сдвигаемых при помощи рычажка. Диафрагмой регулируют количество лучей, посылаемых на объект.

При малом увеличении (объектив 8х) диафрагму конденсора почти закрывают, пока не получится четкое изображение предмета.

Диафрагму суживают при ярком освещении.

Оптическая часть микроскопа состоит из объективов и окуляров.

Объективы являются наиболее важной и ценной частью микроскопа. Каждый объектив представляет сложную систему специально отшлифованных линз, помещенных в цилиндрическую оправу. На верхнем конце оправы имеется нарезка, при помощи которой объективы привинчиваются к револьверу.

Передняя линза, обращенная к предмету, называется фронтальной. Именно ею производится увеличение. Увеличительная способность объектива зависит от кривизны линзы. Чем больше кривизна фронтальной линзы, тем большее увеличение дает объектив. Биологические микроскопы МБИ-1 обычно снабжены тремя объективами с собственным увеличением 8х (восьмикратным), 40х (сорокакратным) и 90х (девяностократным), которые указываются на оправе объективов.

Другие линзы, следующие за фронтальной линзой объектива, называются коррекционными. Они служат для устранения оптических недостатков изображения.

Объективы 8х и 40х являются сухими системами, так как при работе с ними между препаратом и фронтальной линзой объектива находится воздух. Объектив 90-х называется иммерсионным так как при работе с ним между объективом и предметным стеклом наносят каплю иммерсионного масла.

Когда предмет рассматривается сухими системами, то световые лучи, идущие в объектив, проходят через неоднородные среды, различающиеся показателем преломления. Так, показатель преломления стекла п = 1, 52, воздуха п = 1. Поэтому световые лучи, попадая из среды более плотной (стекла) в менее плотную (воздух) сильно отклоняются от вертикальной оси и не все попадают в объектив микроскопа, особенно при малых размерах линз. При пользовании иммерсионным объективом световые лучи проходят через однородную среду, т.к. показатель преломления иммерсионного (кедрового) масла п = 1, 515. Поэтому в иммерсионной системе лучи проходят не преломляясь, не рассеиваясь и не изменяя своего направления, попадают в объектив. Ход лучей в сухой иммерсионной системе представлен на рисунке 2.

Окуляры вставляются в верхний конец зрительной трубки (тубуса).

Каждый окуляр состоит из 2-х плосковыпуклых линз, заключенных в общую трубку. Линзы обращены выпуклой стороной к объективу и удалены друг от друга на расстояние, равное полусумме их фокусных расстояний. Верхняя линза называется глазной, нижняя - собирательной. Увеличение окуляра указывается на самом окуляре: 7х, 10х, 15х в микроскопе МБИ-1. Чем больше собственное увеличение окуляра, тем меньше фокусное расстояние его линз, тем он короче.

Окуляр увеличивает изображение, даваемое объективом, не прибавляя новых деталей структуры рассматриваемого предмета.

Для того чтобы определить общее увеличение микроскопа, нужно увеличение объектива умножить на увеличение окуляра. Так, например, если имеем окуляр 15х, а объектив - 40х, то рассматриваемые объекты будут увеличены в 600 раз (15х40).

 

А Б

Рис.2.

А, Б – иммерсия

В, Г - сухая система

 

При микроскопировании имеет значение не только собственное увеличение микроскопа, но и его разрешающая способность, т.е. наименьшая видимая структура в микроскоп. Разрешающая способность зависит только от объектива, т.к. окуляр увеличивает лишь изображение даваемое объективом. Пределом видимости оптического микроскопа являются объекты не менее 0, 2 мкм. В виду того, что многие бактерии имеют размеры клеток порядка 1-2 мкм, то детали строения их клеток лежат на границе разрешающей способности микроскопа.

Техника микроскопирования

При микроскопировании рекомендуется пользоваться следующими приемами:

1. Препарат помещают на предметный столик микроскопа и закрепляют его боковыми зажимами.

2. Вращая револьвер, устанавливают объектив малого увеличения 8х.

3. Находят правильное освещение препарата. Для этого, пользуясь плоским зеркалом, или светильником направляют свет от источника в конденсор микроскопа, стремясь получить равномерное освещение поля зрения. Лучшее освещение подбирают поднятием или опусканием конденсора и при помощи диафрагмы.

4. Находят изображение при малом увеличении (объектив 8х), фокусируя макрометрическим винтом.

5. Без поднятия тубуса, вращая револьвер, заменяют объектив малого увеличения (8х) на объективы большего увеличения (40х, 90х).

а) При работе со средним увеличением (объектив 40х) диафрагму конденсора слегка приоткрывают, чтобы усилить освещение. Фокусируют при помощи микрометрического винта.

б) При использовании иммерсионного объектива (90х) открывают диафрагму конденсора, чтобы увеличить свет. На препарат наносят каплю иммерсионного (кедрового) масла. Затем, глядя на препарат сбоку (для контроля, чтобы не раздавить стекло и не поцарапать фронтальную линзу объектива), очень осторожно погружают объектив 90х в масло почти до соприкосновения с поверхность стекла, работая макрометрическим винтом. Далее очень медленно поднимают тубус при помощи макровинта до появления в поле зрения изучаемого объекта. Наконец, резкость изображения устанавливают микрометрическим винтом.

Изучаемые объекты, как правило, принято зарисовывать. Для этого препарат помещается в поле зрения микроскопа в положении наиболее удобном для зарисовки, что достигается передвижением предметного столика. Зарисовка производится по возможности точно в отношении размера, формы, расположения клеток бактерий, дрожжей, органов спороношения мицелиальных грибов и т.д.

 

Правила обращения с микроскопом

1. Микроскоп следует оберегать от пыли, т.е. хранить в футляре или под колпаком.

2. Нельзя оставлять микроскоп на солнце или около зажженой горелки, т.к. может расплавиться канадский бальзам, которым склеены линзы в объективах.

3. Окончив просмотр препарата, сначала поднимают тубус, а затем снимают со столика препарат.

4. По окончании работы с микроскопом, подняв тубус и поставив объектив в удобное положение, осторожно, протирают его фронтальную линзу при помощи чистой мягкой хлопчатобумажной ткани или специальной фланели.

5. Особое внимание обращают на иммерсионный объектив, масло с поверхности которого удаляют указанной тканью, смоченной очищенным бензином или спиртом.

Нельзя допускать присыхания масла на объективе.

6. Особенно бережно необходимо относиться:

а) к микрометрическому винту - не делать полных оборотов.

б) к иммерсионному объективу, т. к. из-за короткого фокусного расстояния его фронтальной линзы, легко можно раздавить предметное стекло с препаратом, что может привести к появлению царапин на линзе.

Задание

1. Ознакомиться с устройством оптического микроскопа, правилами обращения с микроскопом и техникой микроскопирования с применением сухих систем и иммерсионным объективом.

Работа 2. МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ И ТЕХНИКА ИХ

МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

Бактерии объединяют обширную группу в основном одноклеточных микроорганизмов, различающихся по форме, размерам, взаимному расположению клеток, наличию или отсутствию спор, жгутиков, капсул и т. д. (Рис. 3, 4).

Для определения группы или вида бактерий, прежде всего, изучают их морфологические признаки: формы и сочетания клеток, их размеры, подвижность, способность к спорообразованию, отношение к окраске по Граму, наличие капсул и клеточных включений. Изучение морфологических признаков бактерий осуществляется обычно с помощью оптического микроскопа.

 

 

Рис. 3. Основные формы бактерий:

1-стафилококки; 2-3-диплококки; 4-стептококки; 5-тетракокки; 6-сарацины; 7-9-различные виды палочек.

 

Рис. 4. капсулы, споры и жгутики бактерий:

а-капсулы; б-форма и расположение спор; в-монотрихи; г-лофотрихи;

д-перитрихи.

 

Для изучения бактерий под микроскопом готовят препараты на предметном стекле. Предметные стекла – это пластинки из тонкого стекла (76х26 мм) с хорошо отшлифованными краями. Сверху препарат закрывается покровным стеклом. Их размеры – 18x18, 20x20 мм и др. Все стекла (предметные и покровные) должны быть совершенно чистыми и обезжиренными. Стекла считаются чистыми в том случае, если вода легко расплывается на поверхности стекла, не образуя капель шаровидной формы.

Очистка новых стекол производится в течение 10 минут в 1% растворе соды с последующей промывкой дистиллированной водой, затем слабой соляной кислотой и вновь дистиллированной водой. Стекла бывшие в употреблении, выдерживаются и концентрированной серной кислоте, промываются водой, кипятятся в 2% растворе соды в течение 10 минут, после чего тщательно промываются дистиллированной водой.

Обезжиренные стекла хранят в закрытой чистой коробке и при употреблении следует их брать так, чтобы не прикасаться к их поверхности.

Микроскопирование бактерий можно проводить, рассматривая их как в живом состоянии, так и в мертвом, в специально приготовленных окрашенных препаратах. Последние весьма широко используются в практике, т.к. вследствие слишком малых размеров клеток бактерий, в живом состоянии не удается рассмотреть некоторые детали их строения, (оболочка, включения, наличие спор), в то время как они более четко выявляются при окрашивании мертвых клеток специальными красками.

Прижизненное наблюдение

Некоторые палочковидные бактерии являются подвижными. Подвижность обусловлена наличием у них жгутиков, тончайших протоплазматических выростов, которые не видны при микроскопировании в оптическом микроскопе. Наличие жгутиков является видовым признаком и всегда учитывается при определении вида бактерий.

Для изучения подвижности обычно берут односуточные или двухсуточные культуры и готовят из них препарат в раздавленной или висячей капле.

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды, в которую петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры бактерий с твердой питательной среды и размешивают до получения однородной суспензии. Если микроорганизмы выращены в жидкой среде, то берут на стекло капли исследуемой жидкости петлей или стерильной пипеткой. Капля накрывается покровным стеклом.

Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под стеклом, не мешают наблюдению. Если их много, то препарат следует переделать. При опускании стекла на каплю прикасаются ребром стекла к краю капли и, постепенно наклоняя, опускают стекло. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не приливалась за края и не попадала на верхняя сторону покровного стекла. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микробные клетки не заслоняли друг друга. Густые препараты разбавляют водой. Приготовленные препараты рассматривают немедленно, т.к. они быстро высыхают. Для микроскопирования на поверхность покровного стекла наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом 90х, в затемненном поле зрения.

Исследование препарата в раздавленной капле позволяет выявить форму, размеры, подвижность клеток.

Активное движение бактерий следует отличать от механического или пассивного движения. Активно двигающиеся бактерии проплывают через все поле зрения, перегоняют друг друга, меняют направления, совершают вращательные движения. Механическое или пассивное движение наблюдается в высыхающей капле, когда в ней возникают токи жидкости увлекающие клетки, которые движутся с одинаковой скоростью в одном направлении. Клетки бактерий можно наблюдать также в раздавленной капле с прижизненной окраской.

Для этого используются малоконцентрированные растворы красок (в концентрации от 0, 01 до 0, 0001%), которые не оказывают губительного действия на живую клетку и дифференцированно окрашивают ее содержимое, позволяя более детально изучать некоторые особенности микробной клетки, например, включения отдельных запасных питательных веществ (гликоген, гранулеза и др.).

Для прижизненного окрашивания применяются: нейтральная красная, метиленовая синь, раствор люголя и др. краски.

Прижизненная окраска используется также для того, чтобы выявить мертвые клетки, т.к. последние легко окрашиваются, а живые клетки долгое время не пропускают краску через свою оболочку и остаются неокрашенными.

 

Окрашивание препаратов и приготовление красителей

В лаборатории практике для окрашивания микробных клеток применяются преимущественно анилиновые краски, которые по своим химическим свойствам подразделяются на основные и кислые.

Из основных красок наиболее часто используются: нейтральная красная, основной фуксин(красные краски), генциан-виолет, метил-виолет(фиолетовые), метиленовая синь (синяя), малахитовая зелень (зеленая) и др.

Из числа кислых красок используется кислый фуксин, эозин (красные) и некоторые другие.

Для изготовления растворов красителей берут сухие анилиновые краски в виде порошков, из которых готовят насыщенные спиртовые растворы. Из этих растворов, путем 5-10 кратного разведения дистиллированной водой, готовят спиртоводные растворы, которые уже используются для окрашивания микробных клеток.

Растворы для окраски фиксированных препаратов:

1.Метиленовая синяя. Насыщенный спиртовой раствор готовят разведением 3 г сухой краски в 100 мл 95° спирта. Через 2-3 дня из полученного раствора приготавливают спирто-водные растворы в концентрации 1: 10 или 1: 40. Для приготовления таких растворов смешивают 1 мл насыщенного спиртового раствора с 10 мл дистиллированной воды (1: 10) или с 40 мл воды (1: 40).

2.Фуксин основной. 10 г краски растворяют в 100 мл 95° спирта. 10 мл насыщенного спиртового раствора разводят в 100 мл дистиллированной воды (1: 10).

3.Фуксин Циля. К 100 мл 5% раствора карболовой кислоты прибавляют 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина. Карболовая кислота улучшает проницаемость оболочки, облегчает восприятие краски протоплазмой клетки. Поэтому фуксин Циля применяют с целью окраски бактерий и спор бацилл с трудом воспринимающих краску. Карболовая кислота предохраняет краску от порчи и фуксин Циля можно хранить в течении нескольких месяцев.

4.Фуксин Пфейффера. Разводят фуксин Циля в 10 раз дистиллированной водой. Эту краску готовят непосредственно перед окраской препарата, т.к. она быстро разлагается.

5.Генциан-виолет. Сначала готовят насыщенный спиртовой раствор, для получения которого берут 10 г краски на 100 мл 95° спирта, и смесь настаивают трое суток, время от времени встряхивая. К отстоявшемуся раствору добавляют 100 мл 3% раствора карболовой кислоты. Полученную смесь перемешивают, тщательно фильтруют через плотный бумажный фильтр и разливают в капельницы.

При стоянии раствора в капельнице происходит медленная кристаллизация и осаждение части краски. Выпавшие кристаллы, попадая на окрашиваемый препарат, затемняют микроскопическую картину. Поэтому при окрашивании препаратов капельницы не встряхивают и берут только прозрачный раствор краски. Генициан-виолет используется для окраски по Граму.

6.Раствор Люголя. 2г KJ растворяют в 5 мл дистиллированной воды и в этот раствор добавляют 1 г йода. Для ускорения растворения эту смесь растирают в фарфоровой ступке, после чего доливают водой до 300 мл. Используется при окраске бактерий по Граму.

Растворы красителей после изготовления фильтруют, разливают в склянки с притертыми пробками и сохраняют в темном месте. Для повседневной работы краски разливают в капельницы с притертыми пробками. Следует учитывать, что при длительном хранении растворов кристаллы краски могут выпадать в осадок, поэтому препарат рекомендуется окрашивать через полоску фильтровальной бумаги.

В лабораторной практике пользуются простыми и сложными методами окраски микробных клеток.

При простой окраске на фиксированный мазок наносят раствор какого-либо одного красителя, например, разведенного фуксина, который интенсивно окрашивает вегетативные клетки бактерий.

Сущность сложных методов окраски заключается в том, что препарат окрашивают не одной, а двумя или большим количеством красок.

Окраска по Граму

Наиболее широко в микробиологической практике применяется сложный метод окраски по Граму (пред ложен впервые в 1884 г. датским ученым X. Грамом). Метод является одним из важнейших опознаватель-ных признаков при определении вида бактерий.

Сущность метода окраски по Граму заключается в том, что все бактерии по способности окрашиваться красителями (генциан-виолет или кристаллвиолет с йодом) делятся на две группы. К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемый указанными красителями, сохраняется после обработки их спиртом. Такие клетки в результате окраски приобретают темно-фиолетовый цвет и получили название грамположительных (грамм+). Например, роды спорообразующих бактерий - Bacillus, Clostridium, среди бесспоровых – роды Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok и др.

К другой группе относятся виды, которые не способны удерживать красящий комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом. Их называют грамотрицательными (грам-). К числу их принадлежат многие виды неспорообразующих палочковидных бактерий, в т.ч. роды Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Proteus и др.

Способность или неспособность клеток удерживать красящий комплекс в настоящее время связывают с химическим составом и структурой клеточных стенок бактерий. В оболочках грам + бактерий содержится больше гликопептида муреина, полисахаридов и тейхоевые кислоты. Они имеют достаточно плотную многослойную структуру. В клетках грам + бактерий генциан-виолет и йод образуют прочное соединение с цитоплазмой, которое не извлекается спиртом. Они сохраняют фиолетовый цвет генциан виолета и при дополнительном окрашивании фуксином Пфейффера.

Оболочки грам-бактерий однослойны, в них отмечено высокое содержание липидов в виде липопргеидов и липополисахаридов. Грам-бактерии при обработке спиртом обесцвечиваются, т.к. у них генциан-виолет не фиксируется в цитоплазме. При дополнительном окрашивании фуксином клетки бактерий окрашиваются только в бледнорозовый цвет.

Грам + отличаются от грам - не только своим отношением к окраске, но и рядом биологических свойств и особенностей. Большинство грам + видов обладают повышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке, радиоактивным и другим типам излучений. В тоже время грам -бактерии более устойчивы к действию щелочей и протеолитических ферментов, а также антибиотиков.

Окраску по Граму используют при определении степени загрязнения пищевых продуктов посторонней, в т.ч. условно патогенной (кишечная группа) микрофлорой, для выяснения диапазона действия антибиотиков и др. целей. Следует учитывать, что некоторые виды бактерий будучи грам + в молодом возрасте, в старых культурах не все интенсивно красятся по Граму. Поэтому для окраски следует брать односуточные или двухсуточные культуры и, кроме того, пользоваться для сравнения контрольными культурами (стандартами), отношение которых к окраске по Граму заранее известно.

Окраска по Граму проводится следующим образом:

1.На одном предметном стекле готовят три мазка из бактериальных культур: заведомо известной Грамположительной, исследуемой и заведомо известной Грамотрицательной.

2.Мазки высушивают и фиксируют пламенем.

3.Окрашивают карболовым раствором генцианвиолета в течении 1-2 мин.

4.Краску удаляют стряхиванием, на мазки наносят раствор Люголя (раствор У в КУ) и выдерживают 1-2 мин. до почернения мазка.

5.Сливают раствор Люголя и на препарат наносят несколько капель 96% спирта и слегка покачивая стекло, выдерживают его до осветления мазка. (20-30с).

Препарат немедленно промывают водой. От обработки мазка спиртом зависит результат всего окрашивания: при недостаточной обработку все бактерии сохраняют окрашивание, при излишней – все клетки обесцвечиваются.

6.Дополнительно окрашивают препарат фуксином Пфейффера (разведенный фуксин) в течение 2 мин.

7.Краску смывают, препарат подсушивают и смотрят с иммерсионным объективом 90х.

Если препарат приготовлен правильно, то в поле зрения видны Грам + темно-фиолетовые клетки и рядом с ними хорошо различаются бледно-розовые Грамотрицательные.

Задание 1

а) Приготовить фиксированные препараты культур бактерий: Pseudomonas fluoresceus, Bacillus Subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina и покрасить фуксином.

б) Микроскопировать все препараты с иммерсионным объективом. Описать и зарисовать, обратив внимание на форму и сочетание клеток. Изучая препараты спорообразующих палочек, найти равномерно окрашенные палочки без спор и палочки со спорами, у которых окрашиваются только контуры и концы клеток, а в центре остаются бесцветные блестящие тельца овальной формы - споры.

Задание 2

Провести наблюдения активной подвижности бактерий в раздавленной капле. Для этой цели приготовить препараты из культур Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis. Смотреть с иммерсионным объективом.

Задание 3

Выяснить отношение к окраске по Граму исследуемых культур бактерий: Bacillus subtilis, Escherichiacoli, Staphylococcus aureus, Erwiniae herbicola. В качестве контрольных использовать культуры: Sar ста(Грам +) и Pseudomonas fluorescens (гpaм-). Микроскопировать с иммерсионным объективом 90х. Зарисовать.

Работа 3. МОРФОЛОГИЯ ДРОЖЖЕЙ И ИХ МИКРОСКОПИРОВАНИЕ

Дрожжи - это одноклеточные грибы, широко распространенные в при роде. Они часто встречаются в почве, в воде, на плодах, листьях винограда, ягодах, составляя их эпифитную микрофлору. Многие виды используются в разных отраслях промышленности - хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении спирта. Имеются вредители, вызывающие порчу пищевых продуктов, нарушающие ход бродильных процессов и даже патогенные дрожжи.

12345678Следующая ⇒

Поделиться: