Приемы техники микроскопирования мицелиальных грибов

Молодые 3-4 суточные колонии грибов, выращенные на среде Чапека можно рассматривать непосредственно в чашках Петри. При этом не нарушается строение органов спороношения и они хорошо различимы даже при микроскопировании с объективом х8.

Для наблюдения нужно открыть чашку Петри, поместить ее на столик микроскопа и пользуясь объективом х8 и макровинтом найти органы плодоношения исследуемых грибов.

Для более детального ознакомления с особенностями строения органов разных видов грибов готовят препарат в раздавленной капле. Для этого двумя препаровальными (миколо-гическими) иглами, предварительно обожженными в пламени горелки, отделяют от питательной среды часть грибной колонии и помещают ее в каплю смеси глицерина с водой (1: 4). На предметном стекле пленку расправляют и накрывают препарат покровным стеклом.

При изготовлении препарата грибов родов Mucor, Rhizopus иглами захватывают только воздушный мицелий, не касаясь питательной среды.

Рис.11. Несовершенные грибы (дейтеромицеты)

l-Fusarium: a- конидии; б- прорастающие конидии; в- молодой мицелий; г - мицелий с конидиями; 2 -Botrytis: а- конидии; б - мицелий; 3 - Alternaria: многоклеточные конидии; 4-Frichothecium: а - конидии; б- конидиеносцы; 5 - Catenularia: конидии в длинных цепочках; 6- Phoma betae: мицелий и конидии.

 

Рис.12 Oidium lactis (ув. 600х)

 

Очень аккуратно переносят частицу мицелия в каплю смеси и осторожно накрывают покровным стеклом.

Препарат грибов в раздавленной капле рассматривают с объективом 40х, т.е. увеличением в 6ООх.

По современной классификации, по морфологическим и культуральным признакам все грибы рода Aspergillus делятся на 14 групп или секций, род Penicillium – на 4 секции. Определяя принадлежность гриба к той или иной секции при увеличении в 600 х на препаратах можно рассматривать форму вздутия на конце конидиеносца у грибов Aspergillus, строение метелки у грибов Penicillium. Применяя иммерсию с объективом 90 х можно исследовать еще более мелкие детали строения разных видов грибов.

Задание 1

Ознакомится с характерными особенностями строения мицелия и органов спороношения грибов Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Fusarium, Alternaria, Cladosporium, Oidium, при микроскопировании 3-4 суточных колоний непосредственно в чашках Петри.

Зарисовать органы спороношения указанных грибов.

Задание 2

Приготовить препараты грибов Aspergillus, Penicillium в капле смеси глицерина с водой. Просмотрев приготовленные препараты с объективом х8 (общую картину строения) и заметив участок наиболее четко отражающий характер плодоношения данного гриба, поставить объектив х40 и при этом увеличении зарисовать гифы, органы спороношения и споры.

Работа 5. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СПОСОБЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ВОДЫ И ПОСУДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

Известно, что клетки большинства микроорганизмов (бактерий, мицелиальных грибов, дрожжей) имеют размеры не превышающие нескольких микрометров(мкм, 1 мкм = 1-10^-3мм) и невидимы невооруженным глазом. Вследствие этого, в микробиологической практике для их выявления, учета, сохранения, а также изучения биологических и технологических свойств живых микроорганизмов применяется их выращивание (культивирование)** на специальных жидких и плотных питательных средах.

При культивировании на плотных питательных средах из отдельных клеток микроорганизмов, содержавшихся в исследуемой пробе того или иного материала (продукта, воды, смыва с оборудования и т.д.) образуются их массовые скопления называемые колониями. Колонии имеют характерные для каждого вида микроорганизмов отличия по размерам, форме, окраске, консистенции и др. признакам. По размерам колонии в большинстве случаев хорошо различимы невооруженным глазом и легко поддаются прямому визуальному подсчету.

Питательные среды используемые для культивирования микроорганизмов должны содержать достаточное количество необходимых для их развития органических веществ - белков, углеводов, витаминов, а также минеральных макро и микроэлементов. Многие виды микробов очень требовательны к составу питательной среды и нуждаются в разнообразном наборе витаминов и ростовых веществ, например молочнокислые бактерии.

Питательные среды могут быть натуральными (естественными) и искусственными. В качестве натуральных сред используются некоторые продукты растительного или животного происхождения: молоко, животные ткани, вареные овощи (картофель, морковь) и др.

На натуральных средах хорошо развиваются многие виды микроорганизмов, однако ввиду сложного и непостоянного химического состава такие среды мало пригодны для изучения процессов метаболизма у микробов. Наиболее широко используются искусственные или полусинтетические среды_, которые готовятся на основе мясных, рыбных и растительных отваров с добавлением дополнительных питательных веществ-пептона, Сахаров, витаминов и др.

По назначению различают универсальные (стандартные) и элективные (избирательные) среды. Универсальные применяются для культивирования многих видов микроорганизмов. Для определения количественного и группового состава мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий (КМАФАнМ) широко используют: мясопептонный бульон (МБП), и мясопептонный агар (МПА). Мясопептонные среды содержат достаточное количество азотистых соединений, необходимых для роста и развития бактерий, постоянно встречающихся на сырье, полуфабрикатах и разных видах пищевых продуктов.

Не охмеленное солодовое сусло и сусловый агар (СА) являются универсальными для многих видов плесневых грибов и дрожжей. Эти среды содержат сахара, необходимые для жизнедеятельности указанных микроорганизмов.

По физическому состоянию различают жидкие и плотные среды. Жидкие (МПБ и солодовое сусло) используют для выяснения физиолого-биохимических свойств микроорганизмов, для накопления биомассы или продуктов обмена.

Плотные среды готовят путем добавления к жидким желатина или агара. Желатин - вещество белковой природы, которое получается при вываривании костей и хрящей. Для создания плотной среды к МПБ добавляют 10-15% нарезанного желатина, и нагревая, расплавляют его, а затем, охлаждая, дают затвердеть. Но желатин имеет большой недостаток, мешающий в практической работе, так как температура плавления его около 24-27 °С. В настоящее время желатиновые среды используются, главным образом при диагностике микроорганизмов. Известно, что одни виды бактерий разжижают желатин (под действием протеолитических ферментов, содержащихся в клетках), а другие не разжижают. Это характерное свойство используется при определении вида бактерий.

Для выращивания микроорганизмов с целью подсчета количества и изучения внешнего вида колоний широко применяют агаровые среды. Агар-агар добывают из морских водорослей, он состоит, главным образом, из сложных углеводородов (полисахаридов). Для получения плотной питательной среды в МПБ или в пивное сусло добавляют 1, 5-2, 5% агара. Температура плавления агара около 100 °С, что является преимуществом агаровых сред, так как на них можно выращивать культуры микроорганизмов при различных температурах. Использование плотных сред необходимо для следующих целей:

а) изучение морфологии колоний – при диагностике микроорганизмов;

б) количественного учета микроорганизмов;

в) выделения и сохранения чистых культур микроорганизмов;

г) определения антагонистических свойств и в ряде других случаев.

Элективные среды по сравнению с универсальными обеспечивают преимущественное развитие одного вида (или нескольких) и мало пригодны для развития большинства микроорганизмов. Применяются, главным образом, для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания, а также получения чистых культур из смешанных. Сопутствующие микроорганизмы на элективной среде или совсем не будут развиваться или их развитие наступит позднее. В качестве примеров элективных питательных сред можно указать МПБ и МПА с 8% поваренной соли для культивирования стафилококков, или пиво с добавлениями 2-4% этилового спирта, для выращивания уксуснокислых бактерий. Для определения потребности микроорганизмов в отдельных элементах питания применяются также синтетические среды, которые приготовляют путем подбора и смешивания различных химических соединений. Примером такой среды являются синтетическая среда-агар Чапека для культивирования мицелиальных (плесневых) грибов. Известно, что важное, иногда решающее влияние на жизнедеятельность микроорганизмов, оказывает реакция среды, т.е. степень ее кислотности или щелочности. При этом реальное влияние оказывает не простое наличие кислоты или щелочи в растворе, а активная кислотность среды, которая зависит от концентрации водородных ионов в среде, т.е. от степени диссоциации кислоты или щелочи на ионы.

Для выражения активной кислотности среды служит условный символ рН, который представляет собой отрицательный логарифм концентрации водородных ионов, взятый с обратным знаком.

Разные виды микроорганизмов развиваются только в определенных границах рН. Для большинства плесневых грибов и дрожжей, молочнокислых, уксуснокислых бактерий наиболее благоприятна слабокислая среда (рН 4, 0 -6, 0), остальные бактерии развиваются в нейтральной или слабощелочной среде (рН 6, 8-8, 0).

При изготовлении питательных сред необходимо каждый раз устанавливать их реакцию. Если реакция не соответствует требованиям данного вида микроорганизма, то среду следует подщелачивать или подкислять, добавляя растворы соответствующих веществ, для подщелачивания — 0, 1 nNaOH или 10% раствор питьевой соды, для подкисления - 0, 1н. НС1 или слабый раствор молочной кислоты. РН среды определяют рН-метром с точностью до 0, 2-0, 3, или с помощью универсального индикатора.

Из числа плотных питательных сред в микробиологической практике наиболее широко для культивирования разных групп бактерий применяется мясопептонный агар (МПА), а для грибов сусло-агар (СА) и синтетическая среда Чапека (ЧА). Питательные (стандартные) среды-мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), агар Эндо и некоторые другие в настоящее время выпускают в виде сухих порошкообразных концентратов. Из них в лабораторных условиях готовят среды, используемые в работе. Способ приготовления указан на этикетке.

Сусловый агар готовят на основе неохмеленного солодового сусла, которое можно получить на пивоваренных заводах или изготовить в лабораторных условиях.

Для приготовления плотной среды к разбавленному суслу добавляют 2-2, 5% агара, расплавляют его при 100°С, фильтруют через вату покрытую марлей, разливают в соответствующую посуду и стерилизуют при 0, 5 атм. В течение 20 мин.

Для культивирования мицелиальных грибов кроме сусло-агара в практике используют также синтетические среды, например агар Чапека, (см. приложение).

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Поделиться: