Биотрансформации стероидных соединений

 

 

Цель лекции: ознакомиться с иммунобиотехнологией, а также основами иммуноферментного анализа; изучить технологию рекомбинантных ДНК и производство лекарственных препаратов, полученных методами генетической инженерии.

 

План лекции:

1. Основа иммунобиотехнологии

2. Иммуноферментный анализ (ИФА)

3. Иммунобиотехнологические препараты

4. Вакцины

5. Сыворотки

7. Спектр биотехнологического производства рекомбинантных белков

8. Промышленное производство рекомбинантного инсулина

9. Биосинтез соматотропина и других гормонов человека

10. Получение интерферонов

11. Моноклональные антитела в диагностике и лечении различных заболеваний.

12. Получение гормональных лекарственных средств на основе

биотрансформации стероидных соединений

 

 

Оснащение лекции: презентация

Место проведения: аудитория 525

 

 

Основа иммунобиотехнологии

 

Иммунобиотехнология основана на реакции антиген (АГ) - антитело (АТ). В качестве примера иммунобиотехнологического генного процесса может служить получение вируса полиомиелита из культуры ткани живого человека для получения вакцины. Биопродукты (вакцины) должны проходить тщательную проверку на безопасность и эффективность. На эту стадию проверки вакцины уходит обычно около двух третей (2/3) стоимости вакцины.

Рассмотрим более подробно вакцины. Вакцины – это препараты, приготовленные из убитых или ослабленных болезнетворных микроорганизмов или их токсинов. Как известно, вакцины применяются с целью профилактики или лечения. Введение вакцин вызывает иммунную реакцию, за которой следует приобретение устойчивости организма

человека или животного к патогенным микроорганизмам. Если рассмотреть состав вакцины, то в них входят:

- действующий компонент, представляющие специфические антигены,

- консервант, который определяет стабильность вакцины при ее хранении,

- стабилизатор, который продлевает срок годности вакцины,

- полимерный носитель, который повышает иммуногенность антигена (АГ).

Под иммуногенностью понимают свойство антигена вызывать иммунный ответ.

В роли антигена можно использовать:

1. живые ослабевшие микроорганизмы

2. неживые, убитые микробные клетки или вирусные частицы

3. антигенные структуры, извлеченные из микроорганизма

4. продукты жизнедеятельности микроорганизмов, в качестве которых используют токсины, как вторичные метаболиты.

Иммуноферментный анализ (ИФА) в медицинской практике

 

Возможности биохимического анализа

Проблема биохимического анализа заключается в способности надежно определять нужное вещество в сложных многокомпонентных системах (средах). В решении этой проблемы применяется ИФА как наиболее специфичные, основанные на реакции связывания антител с антигеном в прочные комплексы. Высокая специфичность антител к широкому кругу различных веществ в сочетании с чувствительными методами регистрации, образующихся комплексов, обуславливает интенсивное развитие ИФА в различных областях медицины, ветеринарии, экологии.

 

Иммунохимические методы

 

Известно, что главным компонентом иммунохимической реакции являются антитела (или иммуноглобулины), представляющие белки сыворотки крови, которые синтезируются в организме человека как проявление защитной реакции иммунитета при попадании в него чужеродного вещества (ксенобиотика) – антигена. Что касается структуры антител, то основным элементом ее является четырехцепочечная молекула из двух пар идентичных полипептидных цепей: легких (L) и тяжелых (Н) с молекулярной массой 22000 и 50000-70000 грамм моль соответственно. Все цепи соединены дисульфидными связями. К обеим тяжелым цепям ковалентно присоединены олигосахаридные фрагменты (см. рис.) Схематическая структура молекул иммуноглобулина представлена на рисунке. Различают 5 классов иммуноглобулина человека это IgG, IgM, IgА, IgE, IgD, полипептидные цепи которых образуют глобулярные домены из 110 – 115 остатков. Концевые домены и определяют биологические свойства иммуноглобулинов. Вариабельные домены легких и тяжелых цепей образуют активный центр антител соответствующей специфичности.

Во взаимодействии с антигеном принимает участие большое количество аминокислотных остатков молекулы антигена.

Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, которые получили название антигенных детерминант. Антигенные детерминанты представляют собой выпуклые части молекулы, которые могут входить внутрь активного центра антител. В случае бактериальных клеток в качестве антигенных детерминант выступают короткие цепочки из 3-5 остатков сахаров, образующие стенку бактерий.

Низкомолекулярные соединения, например, некоторые лекарственные средства, сами не могут вызывать образование антител. Их называют гаптенами. Однако, после присоединения гаптенов к поверхности макромолекулы, организм начинает вырабатывать на них антитела.

Получение антител. Отвечая на этот вопрос, надо знать что такое иммунный ответ.

Иммунный ответ - это сложный процесс межклеточного взаимодействия различных типов лимфоидных клеток с участием специальных гормонов, в результате чего так называемые В-клетки активно синтезируют специфические антитела против данного антигена.

Для получения антител берут животных – это могут быть мыши, морские свинки, кролики, куры, овцы, козы, куры, лошади и делают им инъекции антигена. В присутствии стимуляторов иммунного ответа, в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Обычно антитела выделяют из сыворотки в виде гаммаглобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом или полиэтиленгликолем. Эти антитела имеют иного примесей белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии на иммуносорбентах.

Антитела, однородные по структуре и специфичности, производимые в неограниченных количествах называются моноклональными антителами.

 

Моноклональные антитела

Способ получения моноклональных антител. Такой способ был предложен в 1975 году учеными Г.Келером и К. Мильштейном. Они вводили антиген в организм мыши и получали активно продуцирующие антитела β - клетки. Эти клетки могут жить только в организме хозяина, но если соединить иммунную клетку с клеткой опухолевой (эти клетки называют миеломные лимфоциты), то образуются гибридные клетки со свойствами своих предшественников, так как они способны долго жить в искусственных условиях и одновременно синтезировать антитела. Такие клетки называются гибридомами. Существуют методы отбора отдельных клеток, синтезирующих только один тип антител. Такие клетки помещают в культуральную жидкость, где они растут, образуя много родственных «клонов», синтезирующих большое количество антител под названием моноклональных. Отсюда возникает название монаклональные антитела.

 

Принципы ИФА.

 

Проведение иммунохимического анализа.

Примером проведения такого анализа может служить хорошо Вам известная реакция гемагглютинации, когда взаимодействие белковых антигенов с антителами вызывает их осаждение, то есть преципитацию. Это только качественный или полуколичественный метод.

Проблема установления концентрации антигена решается на основе конкурентного связывания антителами меченного и немеченого антигена, что обусловило, (определило) широкое практическое применение этого принципа.

Итак, иммуноферментный анализ применяется в том случае, если можно:

1. получать специфические антитела,

2. получить высокоочищенные антигены,

3. ввести метку, «маркер» в исследуемое вещество,

4. разделить связанные и свободные компоненты реакции,

5. выбрать метод определения концентрации «маркера»,

6. оптимизировать и стандартизовать условия проведения анализа.

 

 

В качестве «маркеров» применяются

1. радиоактивные метки (это радиоиммунный анализ (РИА, с использованием радиоактивных атомов – тритий, радиоактивный иод и другие).

2. ферментные метки (если ферменты стабильны, активны и действуют в минимальных концентрациях). Суть: субстрат превращается в продукт и далее обнаруживается фотометрическим методом.

3. Субстратные метки (АТФ и НАД), которые «пришиваются» к молекуле антигена через адениновый остаток и сохраняют способность взаимодействия с ферментом.

Для введения ферментативной метки применяются химические, биохимические, иммунологические способы.

 

⇐ Предыдущая10111213141516171819Следующая ⇒

Поделиться: