Промышленное производство рекомбинантного инсулина

Инсулин – это белок, который является гормоном поджелудочной железы. Действие инсулина в основном направлено на обмен углеводов и проявляется снижением уровня сахара в крови (гипогликемический эффект). Это происходит за счет того, что инсулин облегчает переход глюкозы в клетки органов и тканей, где стимулирует ее активирование путем образования глюкозо-6-фосфата. Последний, окисляясь, обеспечивает клетки энергией. Таким образом, инсулин способствует периферическому окислению глюкозы. Наряду с этим инсулин тормозит распад гликогена в клетках печени. При этом снижаются процессы распада жиров и превращение аминокислот в глюкозу и происходит активирование синтеза жиров и белков. При недостатке инсулина развивается тяжелое заболевание – диабет; при этом разрушается нормальный обмен веществ. Диабетики должны получать инсулин ежедневно, если этого не происходит, то развивается тяжелое состояние – диабетическая кома, и организм погибает. Потребность в инсулине огромна. Долгое время источником инсулина служили железы коров и свиней. Учитывая, что поджелудочная железа коровы весит 200–250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина нужно 800–1000 кг исходного сырья.

Понятно, что животный инсулин не мог обеспечить всех больных. Например, в 1979 г. из 60-ти млн больных диабетом во всем мире, только 4 млн получали препарат инсулина.

Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет – 1 типа).

При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина.

 

 

 

Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей:

А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков.

В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков

Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина.

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина, так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида, состоящего из 35 аминокислотных остатков.

С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в активный инсулин.

Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении инсулина биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода.

Итак, преимущества получения инсулина биосинтетическим путем.

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один способ получения инсулина – из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин, получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков, отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови

образующимися антителами.

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli.

Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов

(восьмидесятых годов).

Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli- Эли-Лилли, Соединенные Штаты Америки):

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические гены.

2. этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген в ключают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться бурной репликации плазмид.

4. этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli – кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-цепь.

5. этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов,

синтезирующих А и В цепи.

6. этап. Клетки лизируют, выделяют А и В цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение А и В цепей.

7. этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Рис.2

Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своей структуре. Применение современных методов очистки исключает наличие в инсулине эндотоксинов и пирогенных примесей. Контроль концентрации инсулина в крови человека

1. Определение концентрации глюкозы в крови человека

2. Применение метода радиоиммунного анализа (РИА).

Остановимся на применении радиоиммунного анализа. Для его проведения необходим специальный набор реагентов и счетчиков.

Принцип радиоиммунного анализа (РИА)

Вначале инсулин метят радиоактивным иодом I 125. Затем берут определенное количество антител к инсулину в определенном объеме сыворотки и добавляют их к пробе крови (предварительно разведенной), в которой содержится немеченый (нерадиоактивный) инсулин из организма человека. Комплекс антигена (АГ) инсулин+ антитело (АТ) выпадает в осадок. Затем в эту же пробирку добавляют инсулин меченный радиоактивным иодом. В этом случае, оставшиеся после реакции с нерадиоактивным инсулином, антитела реагируют уже с радиоактивным инсулином и образующийся комплекс также выпадает в осадок. Полученный таким образом общий осадок отделяют от реакционной смеси и определяют в нем радиоактивность. Закономерность получается такая: чем меньше инсулина в крови человека, тем больше свяжется меченого инсулина с антителами (так как останется больше не прореагировавших антител) и соответственно тем больше будет радиоактивность. Этот метод позволяет определить инсулин в концентрации 10 - 9 -10 -12 грамм на миллилитр (г/мл). Этот метод позволяет определить меченый инсулин независимо от любых примесей, которые могли бы исказить результат

анализа.

Что необходимо иметь для проведения такого анализа?

В специальном наборе должны быть

-антитела к инсулину (эти антитела находятся в сыворотке лабораторных животных),

- проба крови с инсулином от испытуемого,

- оборудование для отделения осадка в котором можно измерить радиоактивность,

- счетчик ГСБ-1.

Если в целом представить себе схему этого анализа, то она выглядит следующим образом:

Рис.3

⇐ Предыдущая12131415161718192021Следующая ⇒

Поделиться: