Биосинтез соматотропина и других гормонов человека

Гормон роста человека, или соматотропин, синтезируется в головном мозге человека в передней доли гипофиза. Впервые он был выделен из трупного материала и очищен в 1963 г. При недостатке соматотропина развивается гипофизарная карликовость, частота встречаемости которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион человек. Гормон обладает видовой специфичностью, т. е. в отличие от инсулина гормоны роста животных не имеют активности в организме человека. Следовательно, единственным средством излечения гипофизарной карликовости является гормон гипофиза, который выделяли из трупов. Исследования показали, что при внутримышечном введении соматотропина в дозах 10 мг на 1 кг массы в течение года по три инъекции в неделю дает увеличение роста примерно на 8–18 см в год. Больные дети четырех-пяти лет при непрерывном лечении догоняли в росте своих сверстников к половой зрелости (14–16 лет).Если учесть тот факт, что из одного трупа можно получить 4–6 мг соматотропина, то можно понять, что лечение этого заболевания природным соматотропином – дело совершенно безнадежное. Помимо недостатка препарата возникли и другие проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала. Существовала также опасность, что гипофизарный материал заражен медленно развивающимися вирусами. Такие вирусы обладают необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие препарат, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении.

Гормон роста человека, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободны от вирусных загрязнений.

Биосинтез соматотропина (состоящего из 191-го аминокислотного остатка) специально сконструированными бактериями на основе кишечной палочки был осуществлен фирмой «Генентек». Поскольку при синтезе ДНК на и-РНК получается ген, кодирующий предшественник соматотропина, не расщепляющийся в бактериальных клетках с образованием активного гормона, то поступили следующим образом: на 1 этапе клонировали двунитевую ДНК-копию и-РНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, кроме 23-х первых аминокислот. Затем клонировали синтетический полинуклеотид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединили вместе и «подстроили» в плазмиду E. coli, после чего клетки бактерии начали синтезировать этот гормон.

К 1980 г. были закончены клинические испытания препарата и тесты на токсичность и были начаты массовые эксперименты на детях, близких по возрасту к половой зрелости. Результаты были обнадеживающими, и синтетический соматотропин с 1982 г. начал производиться в промышленном масштабе.

b-эндорфин. Еще один гормон, b-эндорфин – опиат мозга, состоящий из 31-й аминокислоты, – был синтезирован в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. В 1980 г. австралийский ученый Шайн и американские ученые Феттес, Лэн и Бакстер успешно клонировали ДНК, кодирующую b-эндорфин, в клетках E. сoli и получили этот полипептид в виде слитного белка с ферментом b-галактозидазой. На первом этапе они клонировали фрагмент ДНК, полученный в результате обратной транскрипции и-РНК, кодирующей b-эндорфин, и далее встраивали его в плазмиду E.coli за геном b-галактозидазы, при этом получили гибридный белок, состоящий из b-галактозидазы и b-эндорфина; далее ферментативно отщепляли b-галактозидазу, получая биологически активный b-эндорфин.

Эритропоэтин. Эритропоэтин – гормон гликопротеиновой природы, стимулирующий пролифрацию и дифференцировку эритропоэтин-чувствительных клеток в морфологически распознаваемые эритробласты. Это полипептид, состоящий из 165 аминокислот с м.м. 30400. Эндогенный эритропоэтин выделяется в почках в ответ на тканевую гипоксию. При анемии индукция эритропоэтина повышена, что стимулирует образование эритроцитов в костном мозге и проводит к коррекции анемии. Эритропоэтин показан больным с почечной недостаточностю и выраженной анемией. Он павышает уровень гемоглобина, эритропоэтин полезен при СПИДе и раке. эритропоэтин выделен первым из всех гемопоэтических факторов (впервые получен из мочи тяжело больных анемией). Получение значительных количеств эритропоэтина из природных источников практически невозможен из-за низкого содержания его в сырье. С использованием генно-инженерной технологии в культуре клеток млекопитающих (штамм СНО) получают рекомбинантный человеческий эритропоэтин. Производство основано на комбинации аффинной и ионно-обменной хроматографии и позволяет получать практически гомогенный, мономерный полностью активный белок, не содержащий значительных примесей. Уже много лет получаемый по новой технологии эритропоэтин является ведущим продуктом предприятия Amgen Калифорния.

Эритропоэин относится к четырем генно-инженерным препаратам, производимым в России. В частности, НПО «Микроген» выпускает «Эритростим», представляющий высокоочищенный (95, 5%) рекомбинантный эритропоэтин человека с сывороточным альбумином в виде раствора на изотоническом цитратном буфере.

Получение интерферонов

Еще одним замечательным достижением генной инженерии является синтез интерферона. Впервые интерферон был получен в 1957 г. в Национальном институте медицинских исследований вблизи Лондона. Это белок, который выделяется в очень низких количествах клетками животных и человека при попадании в организм вирусов и направлен на борьбу с ними. Первые же исследования выявили высокую биологическую активность ин терферона при лечении гриппа, гепатита и даже раковых заболеваний (подавляет размножение аномальных клеток). Интерферон, как и соматотропин, обладает видовой специфичностью: интерфероны животных неактивны в организме человека и даже отторгаются им.

Интерфероны – группа белковых веществ, вырабатываемых клетками, зараженными вирусами. Интерфероны индуцируют противовирусные реакции

В организме человека вырабатывается несколько видов интерферонов:

α -группа b-группа g-группа

лейкоцитарный интерфероны иммунный интерферон

интерферон фибробластов Т-лимфоциты

 

Природные интерфероны получают из крови человека с крайне низким выходом: в 1978 г. в Центральной лаборатории здравоохранения в Хельсинки (в то время мировой лидер в получении лейкоцитарного интерферона) из 50-ти тысяч литров крови было получено 0, 1г чистого интерферона.

Процесс получения интерферонов в основных чертах был одинаков для всех типов клеток, выращиваемых в культурах и образующих интерферон. Клетки крови заражали вирусом Сендай и через 24 ч фильтровали на суперцентрифуге. В надосадочной жидкости содержался грубый препарат интерферона, который подвергали хроматографической очистке. Стоимость препарата была очень велика – 400 г интерферона стоил 2, 2 млрд долларов. Однако перспективность фармакологического его использования (в том числе против четырех видов рака) заставляла искать новые пути его получения, в первую очередь с помощью генной инженерии.

В январе 1980 г. был получен интерферон человека в генетически сконструированных клетках кишечной палочки. Исходная трудность при этих методах заключалась в том, что и-РНК интерферонов мало даже в лейкоцитах, стимулированных заражением вирусов, и в том, что выходы были очень низкие: сообщалось о получении 1–2 молекул интерферона на одну бактериальную клетку. В 1981 г. фирме «Генентек» удалось сконструировать рекомбинантную ДНК, кодирующую g–интерферон, и ввести ее в геном бактерий, дрожжей и даже клетки млекопитающих, и они стали способными синтезировать интерферон с большим выходом – 1 л культуры клеток дрожжей содержал 1млн единиц интерферона (единица интерферона соответствует такому его количеству, которое защищает 50 % клеток в культуре от заражения вирусом). Процесс был осуществлен следующим образом: исследователи выделили смесь молекул и-РНК из лимфоцитов человека, получили молекулы соответствующих ДНК-копий и ввели их в клетки E. coli. Далее были отобраны бактерии, продуцирующие интерферон.

 

⇐ Предыдущая13141516171819202122Следующая ⇒

Поделиться: