Иммуноаффинная хроматография

Иммуноаффинную хроматографию (ИАХ ) в качестве средства выделения анализируемых веществ из биологических проб стали применять относительно недавно. Суть метода заключается в том, что моно-или поликлональные антитела, способные образовывать нековалентную связь с различными частями анализируемых молекул, пришивают к носителю, например к сферическим частицам агарозы. Гелем, приготовленным из таких частиц, заполняют колонку с пористым фильтром на одном конце и пропускают через нее пробы мочи или плазмы. При пропускании через колонку искомых анализируемых веществ антитела, связанные с носителем, узнают их и связывают, формируя нековалентные комплексы, тогда как остальные молекулы, не способные взаимодействовать с антителами, элюируются с растворителем. Изменение условий элюирования позволяет разрушить комплекс вещество—антитело, не разрушая при этом самих молекул, и получить анализируемое вещество в очищенном виде, практически без посторонних примесей, для проведения дальнейшего анализа, например с помощью ГХ-МС. Химические реакции, лежащие в основе приготовления адсорбента для наполнения колонки, и основные процессы, положенные в основу метода иммуиоаффинной хроматографии, представлены на схеме 5.5. Чаще всего в качестве носителя используют частицы агарозы, которые предлагаются для продажи рядом фирм. Для того чтобы к этим частицам можно было пришить химическим путем пептиды или белки, поверхность этих частиц активируют. Наиболее часто применяют метод активации цианогенбромидом (CNBr), предложенный в 1967 г. Аксеном (Axen et al., 1967). В щелочных условиях CNBr реагирует с гидроксильными группами на поверхности частиц агарозы с образованием циановых эфиров и имидокарбонатов, которые, в свою очередь, вступают в химическую реакцию с антителами (Hermanson et al., 1992). Частицы агарозы с присоединенными к ним антителами, помещенные в колонку, узнают и избирательно связывают только специфические вещества или классы веществ, присутствующие в биологических образцах. Использование подходящих элюентов, например смеси воды и органических растворителей, позволяет освободить связанное с антителами вещество, сконцентрировать его и анализировать при помощи стандартных методов, в частности МС (Schanzer et al., 1996; Machnik et al., 1999). Снижение количества посторонних примесей приводит к улучшению соотношения сигнал/шум и снижению порога детекции методами ГХ-МС и ЖХ-МС/МС.

Метод дериватизации

ГХ-МС является основным инструментом скрининга и получения доказательств в лаборатории допинг-контроля. Такие системы обладают высокой специфичностью и чувствительностью к многочисленным веществам, занесенным в список запрещенных субстанций МОК и ВАДА. Однако для проведения анализа с помощью ГХ-МС вещества должны быть переведены в газообразную форму. Поскольку это требование для многих анализируемых веществ, например Р2-агонистов, различных диуретиков и блока-торов p-рецепторов, выполнить достаточно сложно, путем реакций с различными реагентами получают их более легколетучие производные. Превращениям подвергают в первую очередь гидроксильные группы и вторичные аминогруппы, поскольку именно их способность к гидрофильным взаимодействиям является одной из причин сниженной летучести. Одной из первых осуществлявшихся модификаций анализируемого вещества было ацетилирование с помощью уксусного ангидрида. Образовавшиеся молекулы необходимо было очищать от остатков уксусной кислоты и уксусного ангидрида, что обычно выполняли с помощью жидкостной экстракции. Поскольку этот способ получения производных для ГХ-МС анализа достаточно сложный и трудоемкий, были разработаны несколько дериватизационных агентов, в состав которых, как правило, входят остатки триметилсилила (ТМС). Приводим некоторые из таких агентов: гексаметилдисилазан (ГМДС), триметилсилилимидазол (ТМСИми) и N-метил-N-триметилсилилтрифторацетамид (МСТФА) (Donike, 1969). Последний является наиболее часто применяемым для дериватизации веществом, в частности в сочетании с иодидом аммония и этаптиолом, который in situ приводит к образованию триметилйодсилана (ТМИС), высокореактивного триметилсилилирующего реагента (Donike, 1973; Donike, Zinunermann, 1980). В присутствии ТМСИ происходит модификация гидроксильных и аминогрупп, а кетоновые остатки превращаются в енол-ТМС эфиры. Несколько других мощных реагентов применялись для введения в анализируемые молекулы трифторацетил (ТФА)-или гептафторбутил (ГФБ)-остатков, а именно N, N-бистрифторацетамид, N-метил-N-бистрифтораце-тамид (МБТФА) (Donike, Derenbach, 1976) или N-метил-N-бисгептафторбутиламид (МБГФБ) соответственно. Трифторацетилирование приводит к формированию более стабильных производных аминогрупп по сравнению с триметилсилилированием, поэтому возможна также избирательная модификация анализируемых веществ ТМС- и ТФА-группами, что делает возможным хроматографическое разделение стереоизомеров таких стимуляторов, как эфедрины (Opfermann, Schanzer, 1996; Thevis et al., 2003b).

Литература

· Aguilera, Rv Catlin, D.H., Becchi, M. et al. (1999) Screening urine for exogenous testosterone by isotope ratio mass spectrometric analysis of one pregnanediol and two androstanediols. Journal of Chromatography В 727, 95-105.

· Aliens, E.J. (1965) General and pharmacological aspects of doping. In: Doping (de Schaepdryver, A. & Hebbelink, М., eds.). Pergamon Press, Oxford: 27-50.

· Axelrod, J. (1954) Studies on sympathomimetic amines. II. The bio-transformation and physiological disposition of d-amphetamine, < /-p-hydroxyamphetamine and dmethamphetamine. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 110, 315-326.

· Axen, R., Porath, J. & Emback, S. (1967) Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides by means of cyanogen halides. Nature 24, 1302-1304.

· Ayotte, C, Goudreault, D. & Charlebois, A. (1996) Testing for natural and synthetic anabolic agents in human urine. Journal of Chromatography В 687, 3-25.

· Beckett, A.H. & Rowland, M. (1965) Determination and identification of amphetamine in urine. Journal of Pharmacy and Pharmacology 17, 59-60

· Beckett, A.H. & Wilkinson, G.R. (1965) Identification and determination of ephedrine and its congeners in urine by gas chromatography. Journal of Pharmacy and Pharmacology Y7 (Suppl.), SI 04-S106.

· Beckett, A.H., Tucker, G.T. & Moffat, A.C. (1967) Routine detection and identification in urine of stimulants and other drugs, some of which may be used to modify performance in sport. Journal of Pharmacy and Pharmacology 19, 273-294. de Boer, D., Gainza Bernal, M.E., van Ooyen, R.D. & Maes, R.A. (1991) The analysis of trenbolone and the human urinary metabolites of trenbolone acetate by gas chromatography /mass spectrometry and gas chromatography/ tandem mass spectrometry. Biological Mass Spectrometry 20, 459-466.

· Bowers, L.D. (1998) Athletic drug testing. Clinics in Sports Medicine 17, 299-318.

· Brad low, H.L. (1968) Extraction of steroid conjugates with a neutral resin. Steroids 11, 265-272,

· Budzikiewicz, H. (1998) Massenspektrometrie. Wiley-VCH, New York.

· Burstin, S. (1963) La Lucha contra el Dopage. Revista de Derecho Sportiva 3, 583-636'.

· Cartoni, G.P. & Cavalli, A. (1968) Detection of doping by thin-layer and gas chromatography. Journal of Chromatography 37, 158-161.

· Deventer, K., Delbeke, F.T., Roels, K. & Van Eenoo, P. (2002) Screening for 18 diuretics and probenecid in doping analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Biomedical Chromatography 16, 529-535.

· Dole, М., Mack, L.L., Hines, R.L. et al. (1968) Molecular beams of macroions. Journal of Chemical Physics 49, 2240-2249.

· Donike, M. (1969) N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid, ein neues Silylierungsmittel aus der Reihe der silylierten Amide. Journal of Chromatogmphy 42, 103-104.

· Donike, M. (1973) Acylierung mit Bis(Acylamiden): N-Methyl-bis(tri-fluoracetamid) und Bis(trifluoracetamid), zwei neue Reagenzien zur Trifluoracetylierung. Journal of Chromatography 78, 273-279.

· Donike, M. & Derenbach, J. (1976) Die selektive Derivatisierung unter kontrollierten Bedingungen: Ein Weg zum Spuren-Nachweis von Ariiinen. Zeitschrift Analytische Chemie 279, 128-129.

· Donike, M. & Zimmermann, J. (1980) Zur Darstellung von Trimethyl-sllyl-, Triethylsilyl- und tert. -Butyldimethylsilyl-enolathem von Ketosteroiden fur gas-chromatographische und massenspektromet-rische Untersuchungen. Journal of Chromatogmphy 202, 483-486.

· Donike, М., Jaenicke L., Stratmann, D. & Hollmann, W. (1970) Gas chromatographic detection of nitrogen-containing drugs in aqueous solutions by means of the nitrogen detector. Journal of Chromatography 52, 237-250.

· Donike, М., Zimmermann, J., Barwald, K.R. et al. (1984) Routinebestimmung von Anabolika im Ham. Deutsche Zeitschrift fur Sportmedizin 35, 14-24.

· Donike, М., Ueki, М., Kuroda, Y. et al. (1995) Detection of dihydrotestosterone (dht) doping: alterations in the steroid profile and reference ranges for dht and its 5 a-metabolites. Journal of Sports Medicine and Physical Fitness 35, 235-250.

· Engelhardt, H., Miiller, H. & Schon, U. (1985) The column. In: High Performance Liquid Chromatogmphy in Biochemistry (Henschen,

· A., Hupe, K.P., Lottspeich, F. & Voelter, W., eds.). VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim: 17-78.

· Fluri, K., Rivier, L., Dienes-Nagy, A. et al. (2001) Method for confirmation of synthetic corticosteroids in doping urine samples by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Chromatography A 926, 87-95.

· Geyer, H., Schanzer, W., Mareck-Engelke, U. & Donike, M. (1996) Factors influencing the steroid profile. In: Proceedings of the 14th Cologne Workshop on Doping Analysis (Donike, M. Geyer, H., Gotzmann A. & Mareck-Engelke, U., eds.). Sport & Buch Straufi, Cologne: 95-114.

· Geyer, H., Schanzer, W., Mareck-Engelke, U., Nolteemsting, E. & Opfermann, G. (1997) Screening procedure for anabolic steroids-the control of the hydrolysis with deuterated androsterone glucuronide and studies with direct hydrolysis. In: Proceedings of the 15th Cologne Workshop on Doping Analysis (Schanzer, W., Geyer, H., Gotzmann, A. & Mareck-Engelke, U., eds.). Sport & Buch Straufi, Cologne: 99-101.

· Hermanson, G.T., Mallia, A.K. & Smith, P.K. (1992) Immobilized Affinity Ligand Techniques. Academic Press, San Diego, CA.

· Hoher, J. & Troidl, H. (1995) Doping im Sport. Deutsche Zeitschrift fur Sportmedizin 46, 270-282.

· Horning, S., Geyer, H., Gotzmann, A., Flenker, U. & Schanzer, W. (1998) Detection of exogenous steroids by, 3C/, 2C analysis. In: Proceedings of the 16th Cologne Workshop on Doping Analysis (Schanzer, W., Geyer, H., Gotzmann, A. & Mareck-Engelke, U., eds.). Sport & Buch Straufi, Cologne: 135-148.

· International Olympic Committee (IOC) (2003) List of Prohibited Substances and Methods of Doping. IOC, Lausanne.

· Iribame, J.V. & Thomson, B.A. (1976) On the evaporation of small ions from charged droplets. Journal of Chemical Physics 64, 2287-2294.

Kebarle, P. & Ho, Y. (1997) On the mechanism of electrospray mass spectrometry. In: Electrospray Ionization Mass Spectrometry-Fundamentals, Instrumentation and Applications (Cole, R.B., ed.). John Wiley & Sons, New York: 3-63.

· Keller, R.E. & Ellenbogen, W.C. (1952) The determination of (/-amphetamine in body fluids. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 106, 77-82.

· Knight, J. (2003) Drugs bust reveals athletes' secret steroid. Nature 425, 752 (News).

· Kolb, H. & Patt, P.W. (1965) Beitrag zum Arzneimitteinachweis in Korperflussigkeiten durch Gaschromatographie. Arzneimittel-Forsdiung 15, 924-927.

· Lang, HJ. & Hropot, M. (1995) Discovery and development of diuretic agents. In: Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 117 (Greger, R.F., Knauf, H. & Mutschler, E., eds.). Springer-Verlag, Berlin: 141-172.

· Leinonen, A., Kuuranne, T. & Kostiainen, R. (2002) Liquid chromatography/ mass spectrometry in anabolic steroid analysis-optimization and comparison of three ionization techniques: electrospray ionization, atmospheric pressure chemical ionization and atmospheric pressure photoionization. Journal of Mass Spectrometry 37, 693-698.

· Lisi, A.M., Trout, G.J. & Kaslauskas, R. (1991) Screening for diuretics in human urine by gas chromatography-mass spectrometry with derivatisation by direct extractive alkylation. Jotimal of Chromatography 563, 257-270.

· Lottspeich, F. & Zorbas, H. (1998) Bioanalytik. Spektrum Akade-mischer Verlag, Heidelberg.

· Louris, J.N., Cooks, R.G., Syka, J.E.P. et al. (1987) Instrumentation, applications, and energy disposition in quadrupole ion-trap tandem mass spectrometry. Analytical Chemistry 59, 1677-1685.

· Louris, J.N., Amy, J.W., Ridley, T.Y. & Cooks, R.G. (1989) Injection of ions into a quadrupole ion trap mass spectrometer. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 88, 97-111.

· Machnik, М., Geyer, H., Horning, S. et al. (1999) Long-term detection of clenbuterol in human scalp hair by gas chromatography-high-resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography В 723, 147-155.

· Masse, R., Ayotte, C, Bi, H.G. & Dugal, R. (1989) Studies on anabolic steroids. III. Detection and characterization of stanozolol urinary metabolites in humans by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography 497, 17-37.

· Mohrke, W. & Ullrich, F. (1995) Metabolism of diuretics. In: Handbook of Experimental Pharmacology, vol. 117 (Greger, R.F., Knauf, H. & Mutschler, E., eds.). Springer-Verlag, Berlin: 173-200.

· Morgan, C.E. (1957) Drug administration to racing animals. Journal of the American Veterinary Medical Association 130, 240-243.

· Opfermann, G. & Schanzer, W. (1996) Trimethylsilylation-aspects for derivatisation. In: Proceedings of the 14th Cologne Workshop on Doping Analysis (Schanzer, W., Geyer, H., Gotzmann, A. & Ma* reck-Engelke, U., eds.). Sport & Buch Straub, Cologne: 247-252.

· Patterson, G.E., Guymon, A.J., Riter, L.S. et al. (2002) Miniature cylindrical ion trap mass spectrometer. Analytical Chemistry 74, 6145-6153.

· Prokop, L. (1970) The struggle against doping and its history. Journal of Sports Medicine and Physical Fitness 10, 45-48.

· Prokop, L. (2002) Zur Geschichte des Dopings. Sportarztewoche, December 1-7, Kaprun.

· Reeds, P.J., Hay, S.М., Dorward, P.M. & Palmer, R.M. (1988) The effect of b-agonists and antagonists on muscle growth and body composition of young rats (Rattus sp.). Comparative Biochemistry and Physiology С 89, 337-341.

· Richter, D. (1938) A colour reaction for benzedrine. Lancet 238, 1275.

· Schanzer, W. (1996) Metabolism of anabolic androgenic steroids. Clinical Chemistry 42, 1001-1020.

· Schanzer, W. & Donike, M. (1995) Synthesis of deuterated steroids for GC/MS quantification of endogenous steroids. In: Proceedings of the 12th Cologne Workshop on Dope Analysis (Donike, М., ed.). Sport & Buch Straufi, Cologne: 93-112.

· Schanzer, W., Delahaut, P., Geyer, H., Machnik, M. & Horning, S. (1996) Long-term detection and Identification of metandienone and

stanozolol abuse in athletes by gas chromatography-high-resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography В 687, 93-108.

· Scott, R.P.W. (1982) Microbore columns in liquid chromatography. In: Techniques in Liquid Chromatography (Simpson, C.F., ed.). John Wiley & Sons, Chichester: 79-96.

· Shackleton, C.H., Phillips, A., Chang, T. & Li, Y. (1997) Confirming testosterone administration by isotope ratio mass spectrometric analysis of urinary androstanediols. Steroids 62, 379-387.

· Sigmund, G., Homing, S., Seinsch, I. & Schanzer, W. (1998) Confirmation of clenbuterol. Proceedings of the 16th Cologne Workshop on Doping Analysis (Schanzer, W., Geyer, H., Gotzmann, A. & Mareck-Engelke, U., eds.). Sport & Buch Straufi, Cologne: 129-133.

· Spyridaki, M.H., Tsitsimpikou, C.J., Siskos, P.A. & Georgakopoulos, C.G. (2001) Determination of ephedrines in urine by gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography В 758, 311-314.

· Stallion, A., Zhang, F.S., Chance, W.T., Foley-Nelson, T. & Fischer, I.E. (1991) Reversal of cancer cachexia in rats by cimaterol and supplemental nutrition. Surgery 110, 678-684.

· Thevis, М., Opfermann, G. & Schanzer, W. (2000) Detection of the plasma volume expander hydroxyethyl starch in human urine. Journal of Chromatography В 744, 345-350.

· Thevis, М., Opfermann, G. & Schanzer, W. (2001) High speed determination of B-receptor blocking agents in human urine by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Biomedical Chromatography 15, 393-402.

· Thevis, М., Schmickler, H. & Schanzer, W. (2002). Mass spectrometric behavior of thiazide-based diuretics after eleetrospray ionization and collision-induced dissociation. Analytical Chemistry 74, 3802-3808.

· Thevis, М., Schmickler, H. & Schanzer, W. (2003a). Effect of the location of hydrogen abstraction on the fragmentation of diuretics in negative eleetrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 14, 658-670.

· Thevis, М., Sigmund, G. & Schanzer, W. (2003b) Confirmation of ephedrines-comparison between GC-MS and LC-MS/MS. In: Proceedings of the 21st Cologne Workshop on Doping Analysis

(Schanzer, W., Geyer, H., Gotzmann, A. & Mareck-Engelke, U., eds.). Sport & Buch Straufi, Cologne: 303-307.

· Thieme, D., Grosse, J., Lang, R., Mueller, R.K. & Wahl, A. (2001) Screening, confirmation and quantification of diuretics in urine for doping control analysis by high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A 757, 49-57.

· Van Eenoo, P., Delbeke, F.T., Roels, K. & De Backer, P. (2001) Simultaneous quantitation of ephedrines in urine by gas chromato-graphy-nitrpgen-phosphorus detection for doping control purposes. Journal of Chromatography В 760, 255-261.

· Venerando, A. (1963) Pathologia del doping e mezzi di control lo. Medicina dello Sport 3, 945-959.

· Ventura, R., Segura, J., Berges, R. el al. (2000) Distinction of inhaled and oral salbutamol by urine analysis using conventional screening procedures for doping control. Therapeutic Drug Monitoring 22, 77-282.

· Vidic, E. (1956) Eine Methode zur Identifizierung papierchro-matographisch isolierter Arzneistoffe. Archives of Toxicology 16, 63-73.

· Voyksner, R.D. (1997) Combining liquid chromatography with elec-trospray mass spectrometry. In: Eleetrospray Ionization Mass Spectrometry-Fundamentals, Instrumentation and Applications (Cole, R.B., ed.). John Wiley & Sons, New York: 323-341.

· Wagner, J.C. (1989) Abuse of drugs used to enhance athletic performance. American journal of Hospital Pharmacy 46, 2059-2067.

· Wheeler, A. (1955) Reaction rates and selectivity in catalyst pores. In: Catalysis, vol. 2 (Emmet, P.H., ed.). Reinhold, New York: 105-165.

· Wilhelm, M. & deStevens, G. (1976) Antihypertensive agents. Progress in Drug Research. 20, 197-259.

· Yamashita, M. & Fenn, J.B. (1984a) Eleetrospray ion source. Another variation on the free-jet theme. Journal of Chemical Physics 88, 4451-459.

· Yamashita, M. & Fenn, J.B. (1984b) Negative ion production with the eleetrospray ion source. Journal of Chemical Physics 88, 4671-4675.

 

⇐ Предыдущая567891011121314Следующая ⇒

Поделиться: