Michael Formana, Dried urine spots for detection and quantification of cytomegalovirus in newborns

Высушенные пятна мочи для обнаружения и количественного определения цитомегаловируса у новорожденных

Высушенные пятна мочи (DUS) было зарегистрировано, чтобы обеспечить простой инструмент скрининга на врожденный цитомегаловирус

(ЦМВ). Мы разработали стандартизованный метод ЦМВ количественной оценки от DUS. Два приложения

20 мкл мочи осталась в ободе диска фильтровальной бумаги и были использованы для определения Аналитическое

Производительность Towne цитомегаловируса шипами в мочу и наносили на дисках. Диапазон измерения от 3,7 до натянутое

≥8.0 log10 копий / мл. Предел обнаружения составляет 22 копий ДНК / диск. Образцы мочи от врожденно инфицированных

новорожденные и отрицательный контроль либо разбавленный в соотношении 1:10 или наносили на фильтровальную бумагу в том же объеме. ДНК

число копий из DUS хорошо коррелирует с числом копий от 1:10 разбавленной мочи, хотя наблюдается тенденция

для более низких уровней от DUS (0,3 log10 разницы). Наш стандартный метод для обнаружения ЦМВ и

Количественное может содействовать проведению исследований ЦМВ с ограниченными ресурсами и позволяют для продольного мониторинга

вирусная нагрузка в пролеченных новорожденных

 

 

Цитомегаловирус (ЦМВ) является наиболее распространенным врожденным приобрел

инфекции, вызывая умственную отсталость и глухоту в инфицированный

дети (Demmler, 1991). Первичная инфекция, реактивация или инфекция

с новым штаммом ЦМВ во время беременности может привести к внутриутробно

передача ЦМВ. Заражение во время беременности, как правило, протекает бессимптомно

и поэтому, как правило, под узнаваемым. Несмотря на

потенциальные разрушительные результаты врожденной цитомегаловирусной инфекции, скрининг

программы еще не доступны. Отсутствие скрининга на ЦМВ

во время беременности приводит к приблизительно 1% врожденной ЦМВ

Распространенность в США среди новорожденных ежегодно доставленных (Kenneson

и Cannon, 2007).

Универсальные программы скрининга новорожденных на метаболические и генетические

расстройства используют сушеные пятна крови (DBS), на котором небольшое количество

крови применяется. Исследования продолжаются, чтобы выяснить, простой и экономически выгодной

метод скрининга врожденной ЦМВ-инфекции, включая

обнаружение ЦМВ ДНК из амниотической жидкости инфицированных матерей

(Лаццаротто и др., 2000), а также из мочи, слюны или крови их

инфицированных детей (Boppana и др, 2005;. Чои и др 2009;.. Lanari и др,

2006; Ямамото и др., 2006). DBS Сообщалось, что не хватает

чувствительность в большом американском исследовании (Boppana и др., 2010), но в последнее время

Европейское исследование показало улучшенную чувствительность (Leruez-Ville и др.,

2011). Сушеные слюна пятна имели превосходную чувствительность (Boppana и др.,

2011), а также отчеты из Японии свидетельствуют о высушенной мочи пятна (DUS) может

также обеспечивают высокочувствительный инструмент скрининга на врожденный CMV

Инфекция, просто вставив фильтровальную бумагу в пеленки младенца

(Нозава и др., 2007). Тем не менее, отсутствие стандартизации в образце

коллекция в настоящее время ограничивает использование сухих пятен для количественного

исследования. Теоретически DUS может служить инструментом не только для

обнаружение ЦМВ, но для продольного мониторинга вирусной нагрузки

особенно у детей, получавших, так как врожденно инфицированных детей пролил

ЦМВ в течение нескольких месяцев до нескольких лет в моче и слюне (Нойола

и др., 2000; Нозава и др., 2007). В это время, количественное определение цитомегаловируса

ДНК ограничена из-за различий в объеме мочи, собранной на

каждый фильтр. Таким образом, сравнительные данные между пациентами или

Продольные данные в пределах того же пациента может быть трудно интерпретировать.

Цель данного исследования состояла в том, чтобы разработать стандартизованный метод

ЦМВ Количественное из DUS, которые могут быть использованы в resourcelimited

областей для будущих исследований ЦМВ. Этот метод может быть использован для

сравнить вирусную нагрузку между пациентами или в продольном направлении в пределах

 

2. Материалы и методы

2.1. Предметы

Сорок два архивных образцов мочи, собранной из врожденно

испытывались инфицированных (п = 27) и неинфицированные новорожденные (п = 15).

 

Количественное ЦМВ в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Предел обнаружения анализ составляет 100 копий / мл (3,0 копий / реакция). измеримы

диапазон 2.4-8.0 log10 копий / мл. ПЦР проводили с использованием 50 мкл

Пробирной включены количественные CMV

AD169 ДНК (Advanced БИОТЕХНОЛОГИИ, Колумбия, штат Мэриленд, США) и

количественно Тоун CMV (VR 977, American Type Culture Collection,

Манассас, Вирджиния, США) в 3,0 и 5,0 log10 копий / мл. Количественный CMV

Данные выражали в виде вирусных копий / мл.

 

Диапазон измеряемых был определен с серийным ЦМВ Тауна

разведений (от 8,0 до 3,0 log10 копий / мл, п = 2 в концентрации) сушат

на фильтровальной бумаге дисков. II) Предел обнаружения (LOD) определяли

используя серийное разведение ЦМВ Тауна, от 10 000 до 500 копий / мл.

Двадцать реплицируется при каждой концентрации сушат на фильтровальной бумаге

Диски и испытаны. УД определяли как концентрацию, при которой

было обнаружено 95% повторностей. III) Точность DUS была определена

с использованием 2 концентрации CMV Тауна (4.0 log10 и 5,7 log10 копий /

мл). Для внутризоновой анализа точности, 20 повторов для каждой концентрации

были проанализированы. Для межпробная точности, 20 дополнительных повторностей

испытаны в разное время, и данные были объединены с первого запуска

20 повторах. IV) корреляция между исходной мочи и DUS

необходимость использования разведенной мочи для коррекции нижнего объема

мочи в DUS (40 мкл) по сравнению с извлеченной аккуратной мочи (400 мкл). предшествующий

чтобы определить это количественное соотношение, влияние мочи

оценивали разведение на ЦМВ количественной оценке. ДНК CMV число копий

обнаружен в 400 мкл исходной мочи по сравнению с количеством

 

Применение вируса Towne на ООС выявил измеримый диапазон

3,7 до ≥8.0 log10 копий / мл (рис. 1). Хотя точек данных в пределах этой

Диапазон линейности продемонстрировал, количественное определение было ниже, чем ожидалось

о чем свидетельствует у перехвата -0.74.

 

Пятнадцать образцов из неинфицированных детей не имели обнаруживаемой CMV

ДНК в разбавленном мочой и DUS. Концентрации ДНК ЦМВ в 27

положительные образцы колебалась от 4,4 до 8,8 log10 копий / мл (среднее значение = 6,5

log10 копий / мл). Три образца имели уровни ДНК CMV, которые были

больше, чем самая высокая концентрация ЦМВ Тауна (8.0 log10

копий / мл) испытания для расчета диапазона измерения. Результаты для них

Образцы по всей видимости, попадают близко к линии регрессии для корреляции всех

образцы. Данные, полученные с помощью DUS и разводили 1:10 мочи были линейно

связанной (наклон = 1,03) и коррелирует (г = 0,97), но не идентичны

(Рис. 4)

Мы сообщаем об успешном применении ООС для обнаружения и

Количественное определение ДНК ЦМВ из образцов мочи. ДНК количество копий

от DUS хорошо коррелирует с числом копий от 1:10 разбавленной мочи,

хотя наблюдалась тенденция к более низкому уровню количественной оценки.

Количественное от 1:10 разбавленной мочи составила 0,3 лог выше по сравнению

к исходной неразбавленной мочи (рис. 3). Одно из возможных объяснений является то, что

ингибиторы ПЦР в моче были разведены. DUS под количественно ДНК,

0,6 log10 копий / мл по сравнению с разбавленной мочой (фиг. 4); следовательно разница в количественной оценке между DUS и исходной мочи было

приблизительно 0,3 log10 копий / мл. Возможный недостаток является DUS

что не все врожденно инфицированных детей будут обнаружены, так как

Предел обнаружения анализа составляет 5403 копий / мл или 22 копий / диск.

Тем не менее, большинство инфицированных младенцев, как ожидается, чтобы пролить выше

уровни ЦМВ и низких shedders может быть на самом низком риске для любого

осложнения от врожденной ЦМВ-инфекции (Boppana и др, 2005;. Lanari

и др., 2006). Поэтому потенциальные преимущества простого анализа может

перевешивают ее нынешние ограничения.

Исследование, проведенное сравнение ПЦР в реальном времени fromDBSwith слюну быстрой культуры

для диагностики врожденной ЦМВ-инфекции показал thatDBS имели низкий

чувствительность и, следовательно, не может быть эффективно использован в качестве скринингового инструмента

(Boppana и др., 2010). В другом исследовании, которое использовали другой

методология (одиночный DBSS диаметром 10 мм были вырезаны в 10-12 тонких

полоски до экстракции ДНК), чувствительность и специфичность для

обнаружение ЦМВ из DBS были 95% и 98%, соответственно, в качестве

по сравнению с CMV ПЦР образца мочи (Leruez-Виль и др., 2011).

В ряде исследований сравнивали методы выделения ДНК из DBS,

предполагая, что некоторые методы могут привести к лучшей чувствительностью, чем

другие в последующих ПЦР в реальном времени анализов (де Врис и др. 2009; Soetens

и др., 2008). Роль DBS в качестве инструмента для скрининга врожденной ЦМВ

инфекции требует дополнительных исследований. Недавнее исследование ПЦР в реальном времени

fromdried слюна тампоны продемонстрировали высокий уровень чувствительности (97,4%)

и специфичность (99,9%) по сравнению с быстрой культурой ЦМВ скрининга

новорожденные для ЦМВ (Boppana и др., 2011). Исследования, проведенные в Японии есть

показано, что ДУС может обеспечить простой и чувствительную альтернативу

универсальный ЦМВ скрининг (Inoue и Koyano, 2008;. Nozawa и др,

2007). В этих исследованиях, фильтровальная бумага были помещены в пеленках младенцев и

затем 3-mmdiscswere используется для выявления ДНК ЦМВ с помощью ПЦР в реальном времени.

Сравнение вирусной нагрузки между ЦМВ-инфицированных детей, не может быть

интерпретированы так как объем мочи поглощается с фильтровальной бумагой,

не нормируется. Таким образом, наши результаты дают newstandardized метод

для количественного определения ДНК ЦМВ с использованием DUS.

Скрининг на наличие врожденной ЦМВ-инфекции может быть

достигается за счет вставки фильтровальную бумагу в пеленки новорожденного. Для этого

Цель, количественное определение не может быть необходимым. Наш анализ является стандартизированной

не предназначен для скрининга, так как она требует сбора мочи и

применение определенного объема на ООС. Скорее всего, наш assaymay обеспечить

простой и быстрый инструмент для обнаружения ЦМВ и количественной оценки от

ДУС в слаборазвитых или развивающихся стран, в которых диагностические

Возможности для ЦМВ отсутствуют. Информация о распространенности ЦМВ от

с ограниченными ресурсами районы в настоящее время ограничено из-за отсутствия

диагностическая инфраструктура (Bates и др, 2008;. Кайе и др, 2008;. Майлз

и др., 2008). Описанный метод может позволить инициирование таких

исследования, которые будут способствовать повышению наше понимание эпидемиологии

врожденная ЦМВ.

 

 

Naoki Nozawa,

⇐ Предыдущая78910111213141516Следующая ⇒

Поделиться: