Разновидности ЭФ: непрерывный, изоэлектрическое фокусирование, изотахофорез, клинический (капиллярный).

ХГ – сорбц. динамич. метод для раздел. в-ва. Основа: разл. в ск. движ. комп. смеси подв. фазы под влиянием неподв. фазы. Классиф.: (1) по сост. фазы: 1. жидкостная (жидк.-жидк., жидк.-тв.), 2. газовая (газо-жидк., газо-тв.). (2) по принципу разделения: 1. адсорбционная (физич. сорбция в-в за счет сил св., носитель – уголь, силикагель; жидкость – элюент (подв. фаза), в-ва промыв. элюирующим буфером, если в-во не связ. с буфером, то оно выходит из колонки – элюат, сорбированные в-ва затем сниж. последовательно); 2. распределительная (распределение в-в между двумя жидкими неперемешив. фазами, неподв. фаза = жидк. в порах носителя, подв. фаза = орг. гидрофобн. в-во). По относительной полярности раств.: нормально-фазовая (неподв. фаза более полярна, напр., хлороформ:метанол), обращенно-фазовая (неподв. ф. менее полярна, напр., метанол:вода). 3. гель-проникающая (молекулярно-ситовая). Мол. разд. за счет разл. спос. проникать в поры сорбента. Носитель пористый. Неподв – внутри гранул (подв. и неподв. – одна и та же жидк.). Оч. крупное в-во не заходит в поры, и оно выходит из колонки в первую очередь, в-во малого размера застревает в каждой грануле. 4. ионно-обменная. Разд. за счет заряда б. Носитель – смолы, у/в. 5. аффинная ХГ. Биоспецифичная. 6. ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная ХГ). Под давлением в 400 бар. Выд. пикомольные концентр. Совм. с распределительной и адсорбционной, колонки исключительно металлические. (3) по форме проведения процесса: колоночная, плоскостная, капиллярная. (4) по направлению движения: восход., нисход., радиальная. (5) одно-/двумерная. (6) по цели: аналитическая, препаративная.

Центрифугирование. Основ. на разном поведении в-в в центрифуг. поле (зав. от плотности, формы, разм.). До 700 000 g. Классиф.: (1) по цели: аналитич./препаративн. (2) виды: 1. дифференциальное (мн. этапов, на каждом – одна фракция по коэфф. седиментации, исп. разл. ск. и время вращ.). 2. зональное проводится в р-ре с градиентом плотности, исп. в осн. в аналитич. Исп. бакет-роторы (пробирка встает горизонтально, зоны разделяются четко).

Очистка белков. -сначала разделение (для этого нужно опираться на разницу в размере, заряде, Mr , способности связываться, растворимости).

1ый подход к очистке. (Базируется на растворимости, высаливание, солевое растворение, широко используют).

 2ой подход. (на основе размера, формы и Mr молекулы)

(Диализ,гель-фильтрация,ультрацентрифугируется, SDS -ПААг ЭФ). Диализ (целофановый пакет или воронка). Гель-фильтрация (большие мол. выходят первыми)

3ий подход. (разделение на основе заряда белка).

Ион-обменная ХГ(хроматография).1ым буфером вымываем раствор,расшатываем 1 связь.уходит №1.Берем более сильный и уходит №2.Еще сильнее и №3.

Высокоэффективная жидкостная ХГ

ЭФ(гель-ЭФ,изоэлектрич.(ЭФ) фокусирование,капиллярный ЭФ)

4ый подход .(разделение с помощью специф.связывания.)

Афинная ХГ-по сродствку.

Осождение антителами.антигены реагир.и уходят в осадок

Очистка от низкомолекул.примесей (гель фильтрация,ультрацентрифугиров;

 4 подхода: диализ-крестализация-обессаливание-ультрафильтрация

10.  Электрофорез как метод разделения белков. Клиническое значение протеинограмм.

Белки, как и а/к, амфотерны благодаря наличию своб. NH₂- и СООН-групп, им хар. все св-ва к-т и осн. В зав. от р-ии среды и соотн. кислых и осн. а/к б. в р-ре несут (+)/(–) заряд → к аноду или катоду → исп. при очистке методом электрофореза. ЭФ – см.№ 9.

 

11.  Хроматографические методы разделения белков. Смотри №9

12.  Оценка степени очистки. Способы определения молекулярной массы белков.

Очистка белков.

-сначала разделение,для этого нужно опираться на разницу в рвзмере,заряде,Mr,способности связываеться,растворимости.

Ый подход к очистке.(Базируется на растворимости,высаливание,солевое растворение,широко используют)

Ой подход.(на основе размера,формы и Mr мол.)(Диализ, гель-фильтрация, ультрацентрифугируется, SDS-ПААГ ЭФ)

Диализ (как целлофановый пакет или воронка).Гель-фильтрация(большие мол. Выходят первыми).

3ий подход.(разделение на основе заряда белка)

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: