Приготовление забуференного изотонического раствора NaCl

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 6Следующая ⇒

Используя маточные растворы фосфатов можно приготовить изотонический раствор с диапазоном рН от 5, 3 до 8, 0. Для этого готовят буферную составляющую в объеме 100 мл (см.таблицу выше), которую далее смешивают с 900 мл изотонического раствора. После этого проводят контроль рН. Если значения последнего отличаются от требуемых, то добавляют натриевую соль, обладающую ощелачивающим действием (если требуется повысить значение рН) или калиевую (если необходимы более низкие значения ) для легкого подкисления. Если необходимо приготовить меньшие количества забуференного изотонического раствора, к примеру всего 100 мл, то количество объемов составляющих пропорционально уменьшают в требуемое число раз (для приготовления 100 мл раствора 90 мл физиологического раствора смешивают с 10 мл буферной смеси).

Эритроцитарные антигены, удаляемые или разрушаемые ферментами

Когда эритроциты обрабатываются папаином или фицином (вероятно тот же эффект оказывают также хемотрипсин и бромелин), антигены M, N, Fy^a, Fy^b, Xg^a удаляются или разрушаются. При обработке трипсином утрачиваются первые 2 и последний из упомянутых эритроцитарных антигенов. Хотя многие исследователи полагают, что разрушаются также и антигены системы Даффи, в действительности этот эффект обусловлен примесями хемотрипсина, часто присутствующими в препаратах трипсина.

Действие ферментов на другие структуры мембраны эритроцитов не столь однозначное. К примеру, в некоторых публикациях описаны факты, указывающие на сохранение на энзимированных эритроцитах антигена S (фицин, папаин). Практически все исследователи отмечают, что антиген s сохраняется на энзимированных эритроцитах а S сохраняется после обработки трипсином. Однако, в то же время известно, что Ss-сиалогликопротеин, отделенный от эритроцитов, может быть рассечен в различных участках действием трипсина, папаина и фицина. При этом, тем не менее, имеются участки, недоступные для действия ферментов. Таким образом, сохранение указанных антигенов при энзимировании зависит отчасти и от концентрации используемых растворов ферментов и длительности энзимирования.

Антиген En^aTS, содержащийся на MN-сиалогликопротеине, разрушается под действием трипсина, фицина и папаина. En^aFS, с другой стороны, теряет свою активность под воздействием папаина и фицина, но выдерживает действие трипсина. Эти антигены более детально рассматриваются в главе 14.

Антигены Sp₁, Pr₁, Pr₂ полностью удаляются под действием трипсина, папаина и фицина, из указанной серии удается " уцелеть" лишь антигенной детерминанте Pr^a, которая, кстати говоря, выдерживает также и действие нейраминидазы.

Как рассматривается более детально в главах 4 и 17, антигены Чидо и Роджерс [Ch^a и Rg^a cоответственно], являются составной частью порции C4d C4-компонента комплемента и присоединяющиеся к эритроцитам путем адсорбции. Они могут быть удалены с эритроцитов путем их обработки папаином или фицином. Разумеется, весьма удивительным является тот факт, что трипсин, рассекающий компонент C4b на C4c и C4d, также разрушает указанные антигены.

Имеются 2 сообщения о том, что антиген системы Лютеран Lu^a разрушается трипсином и хемотрипсином, иммуногематологи должны принять это во внимание. Кроме того, известно, что эти ферменты в комбинации разрушают также антиген К (система Келл) или если сначала действует один, а затем другой фермент (все равно в какой последовательности).

Несмотря на то, что впервые обнаруженные антитела анти-Yt^a (система Картрайт) давали усиленные реакции в непрямом антиглобулиновом тесте с трипсинизированными эритроцитами, было удачно подмечено, что антиген Yt^a может быть полностью или частично разрушен папаином.

Заметки о проназе (в России известна как протеаза-С - примечание В.А.)

Хотя этот фермент не применяется в иммуногематологии так же регулярно как другие упомянутые выше, это одна из самых мощных известных протеаз. Известно, что проназа являет собой смесь нескольких компонентов, среди которых есть фракции, которые по своему эффекту напоминают трипсин и хемотрипсин. Judson & Anstee установили, что проназа в концентрации 1 мг/мл разрушает антигены M, N, S, s, Fy^a, K но не D. Меньшая концентрация 0, 2 мг/мл разрушала все перечисленные антигены кроме K и D.

Примечание Морокова В.А. - в литературе имеются сообщения, что проназа с успехом может применяться для дифференциации антител систем LW [антигены LW^a, LW^b& LW^ab разрушаются проназой] и Rh (указанные антигены сохраняются на эритроцитах, энзимированных проназой).

Ручной тест с полибреном(manual polybrene test)

В течение многих лет полибрен, четвертичный полимер аммония и поливинилпирролидон применялись для ускорения аггрегации эритроцитов и, таким образом, использовались выявления антител в AutoAnalyzer (зарегистрированный торговый знак Technicon Corporation). В 1979 году Richard E.Rosenfield и соавторы внедрили некоторые ручные тесты с использованием поликатиона, протамин-сульфата с целью получить чувствительность тестов, которая приближается к таковой при использовании AutoAnalyzer. В 1980, Lalezari и Jiang описали ручной тест с полибреном, вновь использовав принципы метода, положенного в основу функционирования автоматизированной системы. Метод, описывается ниже в таком виде, каком его описали Lalezari и Jiang в своей первой публикации.

В этом тесте эритроциты инкубируются с сывороткой и растворе LISS в течение одной минуты. Затем добавляется полибрен с целью вызвать аггрегацию эритроцитов. Пробы центрифугируются, надосадочная жидкость полностью удаляется и добавляется глюкозо-цитратный раствор для дезаггрегации эритроцитов. Контакт сыворотки с эритроцитами занимает всего одну минуту, тест может быть полностью выполнен в течение 3-х минут. Следует сказать, что в отношении антител системы Rh данный тест чувствительнее антиглобулинового в 10 - 160 раз. Garratty сообщил, что данный тест является исключительно ценным для скрининга антиген негативных образцов эритроцитов доноров для иммунизированных больных. Используя его можно, к примеру, быстро выявить с- или е-негативных доноров среди большого числа обследуемых. Метод является очень быстрым и весьма экономичным в плане расходования тестовых сывороток, Более того, в полибреновом методе можно с успехом использовать образцы сывороток, которые неактивны при использовании других методов. Некоторые образцы антител системы Кидд, дающие слабые или сомнительные реакции в других методах, демонстрируют резко положительные реакции в полибреновом методе.

В первой публикации, посвященной описанию метода было отмечено, что антитела системы Келл не реагируют достаточно хорошо в полибреновом методе. Соответственно, при работе с этими антителами следует проводить конверсию теста в непрямой антиглобулиновый. При этом следует использовать антиглобулиновый реагент без антикомплементарной фракции анти-С3, поскольку в растворе LISS имеет место интенсивная фиксация компонентов С3 и С4 комплемента на эритроцитах в отсутствие клинически значимых противоэритроцитарных антител.

Необходимые материалы

Раствор низкой ионной силы (LISS)

Растворите 50 г D-глюкозы (декстрозы) и 2 г трилона Б (Na₂EDTA) в 1 литре дистиллированной воды. Храните раствор до использования при 4^оС.

Полибрен (маточный раствор)

Растворите 1 г полибрена в 100 мл 0, 9% растворе NaCl. Храните этот раствор в полимерной таре, поскольку стекло адсорбирует полибрен, поэтому может привести к ослаблению свойств полибрена вызывать аггрегацию.

Рабочий раствор полибрена

Разведите 1 объем 1% маточного раствора в 20 объемах изотонического раствора поваренной соли.

Глюкозо-цитратный раствор

Смешайте 60 мл 0, 2М раствора натрия цитрата трех замещенного с 40 мл с 40 мл 5%раствора D-глюкозы.

Отмывающий раствор для антиглобулинового теста

Смешайте 50 мл 0, 2М раствора натрия цитрата трех замещенного с 950 мл физиологического раствора.

Метод

1.Смешайте в пробирке 0, 1 мл (2 капли сыворотки) с достаточным количеством упакованного осадка отмытых эритроцитов, конечная концентрация последних должна составлять приблизительно 0, 5% (см.далее замечания).

2.Добавьте 1, 0 мл LISS, перемешайте содержимое и оставьте пробы на 1 минуту при комнатной температуре.

3.Добавьте 0, 1 мл (2 капли) рабочего раствора полибрена и перемешайте, оставьте пробы на 15 секунд при комнатной температуре.

4.Центрифугируйте пробы при 1000g в течение 10 секунд.

5.Удалите весь супернатант, свободный от эритроцитов, осушите внутренность пробирок.

6.Добавьте 0, 1 мл глюкозо-цитратного раствора во все пробирки.

7.Закрепите пробирки под углом 45^о и осторожно встряхивайте их приблизительно в течение 10 секунд до тех пор, пока аггрегация эритроцитов, обусловленная полибреном не разойдется.

8.Учтите результаты по наличию или отсутствию агглютинации и запишите результаты (см. замечания).

9.Для отрицательных результатов, требующих конверсии в антиглобулиновый тест, добавьте в пробирки по 0, 05 (1 каплю) глюкозо-цитратного раствора.

10.Тщательно перемешайте содержимое пробирок.

11.Отмойте дважды содержимое пробирок раствором, пропись указана выше.

12.Удалите полностью отмывающий раствор, добавьте АГС, центрифугируйте пробы 15 секунд и осторожно встряхивая последние, учтите результаты. Используйте эритроциты, нагруженные IgG для положительного и отрицательного контролей (более детально см. главу 4).

Замечания

1.Сообщалось, что концентрация рабочего раствора для разных лотов полибрена может варьировать слегка вокруг цифры 0, 05%. Оптимальную концентрацию в этих случаях находят методом проб и ошибок. Метод синтеза полибрена опубликован.

2.В качестве тестируемого материала при скрининге антител и постановке претрансфузионных тестов используют неразведенные сыворотки. Когда проводят поиск антиген негативных образцов эритроцитов, тестовые сыворотки могут быть разведены, чем может быть достигнута большая экономия ценных сывороток. Рекомендуется разводить тестовые сыворотки сывороткой АВ группы, адсорбированной от холодовых агглютининов или, лучше 5% раствором нормальной АВ сыворотки в изотоническом растворе (1 объем сыворотки АВ группы смешивают с 19 объемами изотонического раствора).

3.В первой публикации, описывающей метод, сказано, что при необходимости при учете результата может быть применено микроскопирование.

4.Промедление в учете результата после добавления глюкозо-цитратного раствора может привести к ослаблению выраженности положительных результатов вплоть до исчезновения агглютинации (если это продолжается слишком долго). Рекомендовано, чтобы учет результатов проводился в течение 3 минут с момента добавления глюкозо-цитратного раствора. Тесты не должны подвергаться повторному центрифугированию после добавления глюкозо-цитратного раствора и встряхивания, поскольку это приведет к исчезновению положительных результатов.

5.В первой публикации, описывающей эту технику, рекомендовано двукратное отмывание эритроцитов при конверсии теста в непрямой антиглобулиновый. Без сомнения, найдутся исследователи, которые попробуют поэкспериментировать с количеством отмываний - они легко убедятся в том, что чувствительность теста не снизится и после 3- или 4-х отмываний.

6.Каждую серию тестов рекомендуется проводить, выполняя контрольные положительные и отрицательные тесты. Это необходимо для сопоставления выраженности аггрегации, вызываемой полибреном, ее реверсии после добавления глюкозо-цитратного раствора и встряхивания. Контроли, наконец, позволяют судить о том, как выглядят положительные и отрицательные результаты в полибреновом методе на этапах 8 и 12.

ZZAP обработка эритроцитов

В 1980 году Branch & Petz описали использование раствора, содержащего папаин и дитиотрейтол. Был разработан метод обработки эритроцитов больных с наличием тепловых аутоиммунных противоэритроцитарных антител, позволяющий удалить аутоантитела с эритроцитов. Известно, что такие эритроциты крайне сложно фенотипировать с использованием тест-систем на основе IgG антител, поскольку все они демонстрируют ложноположительные реакции. Было показано, что такая обработка эритроцитов приводит к разрушению антигенов M, N, Fy^a, Fy^b и всех антигенов системы Келл. Таким образом, могут быть искусственно получены эритроциты фенотипа Ко (" Келл-нуль" ).

Приготовление раствора ZZAP

1.Приготовьте 0, 2 М раствор дитиотрейтола растворив 1 г сухого вещества в 32, 4 мл забуференного до 7, 3 изотонического раствора.

2.К 2, 5 мл приготовленного 0, 2 М раствора дитиотрейтола добавьте 0, 5 мл 1% раствора активированного папаина (приготовленного по Low как описано выше) и 2, 0 мл изотонического раствора, забуференного до 7, 3. Тщательно перемешайте путем перевертывания. Конечный раствор должен иметь рН между 6, 0 и 7, 0, может храниться при 4^оС в течение 24 часов.

Обработка эритроцитов

1.Упакуйте обрабатываемые эритроциты путем жесткого центрифугирования и отделения супернатанта. В отмывании их нет необходимости.

2.К каждому 1 мл упакованных эритроцитов добавьте по 2 мл раствора ZZAP.

3.Перемешайте содержимое пробирок и инкубируйте их при 37^оС в течение 30 минут.

4.Отмойте 3 раза изотоническим раствором и используйте для аутоадсорбции или в других серологических тестах.

⇐ Предыдущая 123 4 5 6 Следующая ⇒