Обработка эритроцитов 2-аминоэтилизотиронина бромидом

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 6Следующая ⇒

В 1982 году Advanii и соавт. сообщили, что определенная субстанция (названа позднее 2-АЕТ) приводит к денатурации всех антигенов системы Келл, в то время как эритроцитарные детерминанты других систем остаются неизмененными. Было показано, что эритроциты, обработанные 2-АЕТ, не реагируют с антителами, направленными к антигенам K, k, Kp^a, Kp^b, Kp^c, Js^a, Js^b, Wk^a, K12, K13, K14, K18, K19, K20, K22 или Ku. Более того, после указанной обработки эритроциты не способны к связыванию антител против групповых антигенов системы Келл, что показали пробы с адсорбцией и элюцией. Эритроциты, обработанные АЕТ, реагировали с антителами анти-Kx (известно, что этот антиген находится под контролем гена, связанного с Х-хромосомой и независим от генного комплекса Kell). Однако, Кх фенотипически связан с системой Келл. Дополнительные детали по этому поводу описаны в главе 12, где рассматривается серология и генетика упомянутой системы. После обработки эритроцитов 2-АЕТ эритроциты в большей степени напоминают " Келл-нуль", при этом, в отличие от обработки ZZAP не происходит утраты антигенов систем MNSs и Даффи. Значение этого феномена рассматривается в главе 12. Обработка эритроцитов 2-АЕТ приводится ниже.

Обработка эритроцитов

1.АЕТ может быть приобретен от Calbiochem-Behring Corporation, San Diego, California, препарат стабилен в сухом состоянии при комнатной температуре.

2.Растворите 6 г АЕТ в 100 мл дистиллированной воды, доведите рН до 8, 0 используя 5N NaOH.

3.Смешайте 1 объем отмытых упакованных эритроцитов с 4 объемами 6% раствора АЕТ.

4.Инкубируйте пробу 20 минут при 37^оС.

5.Отмойте эритроциты изотоническим раствором, забуференным до 7, 0. Отмывание производят до тех пор, пока супернатант не станет полностью прозрачным, во время первых отмываний последний может быть гемолизированным.

6.АЕТ-обработанные эритроциты можно хранить при 4^оС в течение 24 часов.

Заметьте: АЕТ следует готовить непосредственно перед использованием

Адсорбционные тесты

Антитела могут быть удалены из сыворотки с применением метода адсорбции на эритроцитах. Сыворотка, содержащая антитела при этом смешивается с эритроцитами, несущими антиген, против которого направлены антитела. Благодаря образованию комплексов антиген - антитело вся активность последних может быть полностью устранена из адсорбированной сыворотки. Практическое значение этого метода отмечено в главах, посвященных описанию системы АВО, идентификации антител и аутоиммунным антителам. В целом можно отметить, что применение адсорбции является полезным в следующих ситуациях.

1.Отделение антител из сывороток, содержащих одновременно антитела нескольких специфичностей.

2.Подтверждение специфичности антител.

3.Приготовление типирующих реагентов.

4.Подтверждение присутствия на эритроцитах слабо выраженных вариантов тех или иных антигенов.

Поскольку целью адсорбции часто является полное истощение активности антител из сыворотки, при этой процедуре применяются другие соотношения сыворотки и эритроцитов, нежели при выполнении агглютинационных проб.

Весьма хорошим в практическом смысле является равные объемы упакованных эритроцитов и адсорбируемой сыворотки.

Метод адсорбции

1.Отмойте эритроциты, используемые для адсорбции 3 раза большими объемами физиологического раствора.

2.После последнего отмывания тщательно удалите все остатки отмывающего раствора, в противном случае последние приведут к разведению адсорбируемой сыворотки. С этой целью дополнительно центрифугируйте сосуд, в котором проводилось отмывание эритроцитов.

3.Осторожно удалите весь изотонический раствор с упакованных эритроцитов.

4.Добавьте сыворотку в объеме, равном объему упакованных отмытых эритроцитов.

5.Тщательно перемешайте пробу и инкубируйте от 30 до 60 минут при температуре, которая оптимальна для действия удаляемых антител.

6.Центрифугируйте пробу и соберите весь супернатант - адсорбированную сыворотку.

7.Если предполагается проводить элюцию, сохраните эритроциты, на которых проводилась адсорбция.

Контроль адсорбции

Если требуется полная адсорбция антител, сыворотка должна быть проверена на полноту адсорбции антител. Это следует сделать, используя свежезаготовленный образец эритроцитов, на которых производилась адсорбция а также с другими пробами, содержащими соответствующий антиген. Исследование следует проводить методом, обладающим наибольшей чувствительностью для обнаружения данного вида антител. Если сыворотка продолжает реагировать с соответствующими образцами эритроцитов, необходимо продолжать адсорбцию с другими порциями антиген позитивных эритроцитов, если того требует конечная цель эксперимента. Некоторые антитела требуют трех и более адсорбций прежде чем наступит полное устранение их действия. Использование энзимированных эритроцитов часто позволяет сократить число процедур адсорбции, необходимых для полного истощения активности антител. Однако, клетки, обработанные энзимами, нельзя использовать, если ферменты разрушают соответствующие антигены эритроцитов (антигены перечислены неоднократно выше).

Элюция антител

После присоединения антител к эритроцитам как in vivo, так и in vitro, последние могут быть отделены методами элюции. Жидкость, содержащую отделенные антитела, называют элюатом. Метод элюции антител представляется ценным в следующих ситуациях.

1.Идентификация специфичности антител в сыворотках, содержащих антитела к различным эритроцитарным антигенам.

2.Подтверждение специфичности антител.

3.Приготовление типирующих реагентов. Если единственным доступным источником антител, к примеру, является сыворотка O(I) группы, а исследовать необходимо эритроциты группы A(II), сыворотка может быть адсорбирована на антиген позитивных эритроцитах группы O(I), полученный с них элюат не будет содержать анти-А и анти-В антител и, таким образом, может быть получен элюат для последующего использования в качестве универсального типирующего реагента, пригодного для исследования любых образцов эритроцитов независимо от их АВО-принадлежности.

4.Подтверждение присутствия слабо выраженных эритроцитарных антигенов.

5.Идентификация антител, послуживших причиной развития гемолитического заболевания новорожденного (ГБН).

6.Идентификация антител, послуживших причиной развития посттрансфузионной гемолитической реакции.

7.Изучение антител у больных с приобретенной гемолитической анемией.

Элюция антител требует такой диссоциации комплексов антиген - антитело, которая оставляет интактной активные центры антител. Многие методы элюции приводят к разрушению эритроцитов и попаданию в элюат гемоглобина.

Предложено огромное количество методов элюции. Строго говоря, все они могут быть подразделены на 3 группы по своему механизму. Первая из них характеризуется тем, что в ней удается получить холодовые антитела либо антитела с широким диапазоном температурного действия. Эти методы особенно ценны в получении антител с эритроцитов, страдающих ГБН в связи АВО-несовместимостью матери и плода. Вторая группа методов позволяет хорошо выделить тепловые антитела класса IgG не способные вызывать агглютинацию в прямых тестах с эритроцитами, которые могут быть как алло-, так и аутоиммунными по своей природе. Третья группа включает методы, которые позволяют отделить антитела с мембраны эритроцитов и после этой процедуры эритроциты пригодны для последующего фенотипирования с тестовыми сыворотками.

По имеющемуся опыту метод элюции с подогревом по Landsteiner & Miller оправдывает себя в ситуациях, когда выделяются холодовые агглютинины либо антитела с широким температурным диапазоном активности. Метод замораживания-оттаивания по Wiener имеет право на применение, однако он несколько громоздкий и длительный. Согласно данным Judd, метод Lui с быстрым замораживанием и оттаиванием также эффективный в использовании.

Для отделения тепловых антител длительное время применяется эфирный метод. Метод элюции антител со стром эритроцитов с использованием эфира впервые описали Vos & Kelsall, позднее Vos & Rubin показали, что антитела можно отделить и с цельных эритроцитов, в выполнении отдельного этапа по получению их стром нет необходимости. Опыт Вашего автора показывает, что этот метод является быстрым и простым, позволяет получить большие количества аутоантител с эритроцитов больных, которые присоединились к ним in vivo или тепловых аллоиммунных антител, которые сенсибилизировали эритроциты in vitro. В отдельных редких случаях, когда возникают проблемы в выделении аутоантител с эритроцитов больных аутоиммунной гемолитической анемией, весьма ценным методом выбора является элюция с использованием дигитонина. Поскольку правила хранения и обращения с эфиром всегда представляли собой целую бюрократическую проблему (вероятно, в США -примечание мое, В.А.), были разработаны альтернативные методы, позволяющие обойтись без эфира при проведении элюции. Сообщалось, что ксилен и хлороформ действуют столь же хорошо, что и эфир. Аналогичным образом была предложена и кислотная элюция на холоду. Несмотря на указанные сообщения об альтернативных методах, Ваш автор использует эфирную элюцию как метод выбора в рутинных ситуациях.

Подбор крови для переливания больным с аутоиммунной гемолитической анемией, обусловленной тепловыми антителами всегда является проблемой. Поскольку действие аутоантител (часто реагирующих сильно со всеми образцами эритроцитов стандартизованной панели) может маскировать присутствие аллоиммунных антител, необходимым условием является адсорбция аутоантител. С этой целью проводится аутоадсорбция, в процессе ее должно быть устранено действие аутоантител, но не аллоиммунных антител. Идеальным является использование для аутоадсорбции собственных эритроцитов больного. Однако, они нередко демонстрирую положительные реакции с силой 4+ в прямом тесте Кумбса и не способны связать дополнительное количество аутоантител. Одним из путей разрешения проблемы удаления антител с эритроцитов является метод Stratton & Renton, который позднее модифицировал Morrel в котором удается добиться частичной элюции аутоантител с помощью подогрева без разрушения эритроцитов. Позднее Edwards и соавт. описали использование хлороквина для элюции антител с эритроцитов с одновременным сохранением последних для адсорбции.

Как уже отмечено выше, существует много методов элюции. Ваш автор описывает те, которые использовались им на практике и показали свою эффективность. Это вовсе не означает, что следует пользоваться только теми, которые описываются далее. Возможно использование также и других существующих техник.

Некоторые исследователи считают, что элюция антител в изотонический раствор делает элюаты нестабильными для хранения и поэтому предпочитают элюировать антитела с эритроцитов в сыворотку группы АВ или 6% бычий альбумин. Если элюат исследуется в день его приготовления, то вполне можно элюировать антитела в изотонический раствор. Однако, если последующие исследования предполагается выполнить позднее и предполагается хранения элюата, то целесообразнее использовать именно эти среды. Другой важнейшей проблемой является качественное выделение только тех антител, которые действительно специфически связаны с эритроцитами. По этой причине процедуре элюции во всех случаях предшествует тщательное 6-кратное отмывание эритроцитов. Полезным является параллельный (одновременно с исследованием элюата) контроль наличия антител в последнем (полученным после 6-го отмывания) отмывающем растворе, который во всех случаях должен быть отрицательным. Только в этом случае можно с уверенностью утверждать, что любая активность элюата обусловлена антителами, которые до процедуры действительно были фиксированы на эритроцитах.

Элюция методом подогрева по Lansteiner & Miller

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К упакованным отмытым эритроцитам добавьте равный объем изотонического раствора (сыворотки АВ или 6% бычьего альбумина)

4.Поместите пробирку на водяную баню при 56^оС на 10 минут. В течение 15 секунд на протяжении каждой минуты интенсивно болтайте пробирку в воде.

5.Центрифугируйте пробирку в жестком режиме однократно. Идеально, если центрифуга с подогревом. В стаканчики центрифуги можно налить горячую (56^оС) воду.

6.Соберите элюат (супернатант, загрязненный гемоглобином).

Замечания.

1.Одно время думали, что если элюат охлаждается, то элюированные антитела быстро вновь фиксируются на строме эритроцитов. Последующие исследования показали, что этот процесс происходит достаточно медленно и практически не влияет на активность полученного элюата.

2.Если не удается получить активные элюаты, то увеличивают силу подогрева. Иногда для элюирования антител подогрев до 60^оС и даже до70^оС более эффективен, нежели до 56^оС.

⇐ Предыдущая 1 234 5 6 Следующая ⇒