Метод с инкубацией при комнатной температуре

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Любой иммуногематолог должен профессионально владеть целым рядом методов исследования. Собственный опыт применения тестов в повседневной работе данными методами при этом должен внушать исследователю полное доверие к полученным результатам тестов. Разумеется, было бы чересчур претенциозным попытаться в одной главе привести перечень всех известных методов иммуногематологического исследования и предлагать их в качестве предпочтительных. Исходя из положения, что самым главным в любой технике является создание оптимальных условий для взаимодействия в системе антиген - антитело, каждый конкретный исследователь так или иначе подберет для себя набор тестов, которые считает наилучшими для повседневной работы.

Методы, которые описываются далее, предлагаются вниманию тех иммуногематологов, которые еще не определили для себя собственный набор методов, которыми они в дальнейшем предпочтут пользоваться. Эта глава адресована также и тем, кто ранее не использовал описываемые здесь методы - можно попробовать освоить их и, таким образом, расширить перечень применяемых in vitro тестов. Опыт подсказывает, что в ситуациях, когда возникают проблемы в выявлении или идентификации некоторых видов антител, наихудшим является смена одних методов исследования на другие. В заключение можно подчеркнуть, что в описании методов акцент сделан на выявление антител, имеющих клиническое значение. Вполне возможно, что ряд читателей после ознакомления с этой главой скорректирует или как-то изменит арсенал своих методов.

Методы, приводимые в данной главе, чаще описаны целиком (приведены все этапы исследования). Разумеется, можно применять и комбинации методов, конвертируя одни тесты в другие, при этом реакции проводятся в одних и тех же пробирках при выполнении серии исследований. В качестве хорошего примера могут быть приведены солевой, альбуминовый или тесты с использованием энзимов. На практике они очень часто далее конвертируются в непрямой антиглобулиновый тест. Композиции этих тестов приводятся еще раз в главе 23, где описаны тесты на совместимость перед гемотрансфузией.

Далее, в начале каждой главы, посвященной различным групповым системам дан только перечень наиболее оптимальных тестов, само их описание в них не приводится. Методы выполнения антиглобулиновых тестов и их принципы детально рассматриваются в главе 4.

Контроли

Прежде чем описывать специфические методы, необходимо затронуть важный вопрос о выполнении контрольных проб. Например, когда должна быть исследована неизвестная сыворотка, должен быть выполнены также и контрольные исследования этой сыворотки с собственными эритроцитами обследуемого лица. При этом с ними все выполняется точно так же, как и с фенотипированными клетками панели, по которой устанавливается специфичность антител. В большинстве случаев более интенсивные реакции наблюдаются с эритроцитами панели, нежели с собственными, при этом можно утверждать, что выявлены аллоиммунные антитела. При работе с известными антисыворотками следует проводить тесты не только с испытуемыми но и контрольными антиген позитивными и антиген негативными эритроцитами.

Следует внимательно оценивать положительные реакции, по возможности проводить контрольные исследования с образцами эритроцитов, содержащие слабовыраженные антигены. Например, при работе с тест-системами анти - Jk^a следует брать в качестве отрицательного контроля эритроциты группы Jk(a-b+), в качестве положительного - Jk(a+b+), а не Jk(a+b-). В этом случае (при получении соответствующих результатов) исследователь может быть уверенным, что антисыворотка выявляет " одну" дозу антигена Jka. Соответственно, среди испытуемых эритроцитов могут быть идентифицированы точно такие же образцы группы Jk(a+b+). Выполнение положительного контрольного теста с " двойной дозой" антигена Jk^a путем использования клеток фенотипа Jk(a+b-) представляется куда менее ценным и информативным.

Капля эритроцитов

Для приготовления сухой капли эритроцитов поместите одну каплю 2-5% взвеси эритроцитов в пробирку, в которой должен проводиться тест. Заполните пробирку до верху изотоническим раствором поваренной соли и центрифугируйте пробирку при 1000g в течение 30 секунд. Удалите весь изотонический раствор, оставив только кружок на дне пробирки. Тестовая сыворотка теперь может быть добавлена прямо в эту же пробирку. ВО ВСЕЙ ЭТОЙ ГЛАВЕ ПРИ ОПИСАНИИ ВСЕХ БЕЗ ИСКЛЮЧЕНИЯ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ОДНА КАПЛЯ 2-5% ВЗВЕСИ ЭРИТРОЦИТОВ МОЖЕТ БЫТЬ ЗАМЕНЕНА СУХОЙ КАПЛЕЙ ЭРИТРОЦИТОВ. Однако, использование суспензий эритроцитов вместо сухой капли приводит к некоторому разведению тестовых сывороток и, следовательно, снижает чувствительность тестов. Удобством приготовления сухой капли является необходимость хотя бы однократного отмывания эритроцитов (это снижается вероятность неспецифических реакций). С другой стороны, такие эритроциты являются более хрупкими и могут подвергаться гемолизу в процессе выполнения того или иного теста. Хотя в большинстве случаев подразумевается, что тесты выполняются с 2-5% взвесью клеток, исследователи часто имеют индивидуальные предпочтения в этом плане. Некоторые из них предпочитают работать с 4-6% взвесями клеток. Следует обращать внимание на то, чтобы концентрация взвеси не превышала 6%, в противном случаев чувствительность реакций может заметно снизиться.

Метод немедленного центрифугирования (immediate spin method)

1.В пробирку, содержащую сухую каплю эритроцитов, приготовленную как описано выше, добавляют 2-4 капли тестовой сыворотки.

2.Тщательно перемешивают.

3.Центрифугируют при 1000g в течение 15 секунд.

4.Осторожно встряхивают пробирку для ресуспендирования эритроцитов, читают тесты и записывают результаты.

Другие методы тестирования сывороток, содержащих холодовые антитела

В ряде случаев связывание комплемента холодовыми агглютининами невозможно предотвратить путем аутоадсорбции. В этих случаях может быть использовано 2 других техники исследования.

Тесты с анти-IgG

Если проблемой является выявление комплемента, который связали холодовые антитела, то непрямой антиглобулиновый тест должен проводиться с использованием антиглобулинового реагента анти-IgG без антикомплементарной фракции. При проведении тестов на совместимость в этой модификации IgG аллоантитела успешно выявляются. Некоторые аллоиммунные антитела выявляются только посредством механизма C3-анти-С3, однако вероятность, что одна и та же сыворотка содержит такие антитела одновременно с высокоактивными холодовыми аутоагглютининами ничтожно мала.

Использование 2-меркаптоэтанола (2-МЕ) или дитиотрейтола (ДТТ)

Как будет описано более детально далее в этой главы, 2-МЕ или ДТТ могут использоваться для обработки сыворотки с целью устранить действие IgM агглютининов. Хотя после такой обработки агглютинины сохраняют способность связывать комплемент (мономеры IgM обладают такой способностью), эта активность снижается настолько, что не улавливается в непрямом антиглобулиновом тесте. Таким образом, сыворотка, содержащая холодовые агглютинины, способные активировать комплемент, может быть обработана 2-МЕ или ДТТ и далее использована для проведения тестов на совместимость для выявления аллоиммунных IgG антител, если сыворотка содержит таковые.

Метод сбора антител

Когда для исследований применяются очень редкие и ценные сыворотки, некоторое их количество может быть собрано после проведения исследования. Пробирки с отрицательными результатами центрифугируются, супернатант собирается в отдельную пробирку или флакон для повторного использования. Таким способом сыворотка может длительное время использовать повторно, особенно в тех случаях, когда исследуемый антиген встречается редко. Необходимо помнить, что в процессе проведения исследований происходит некоторое разведение тестовой сыворотки. В этой связи необходимо несколько увеличивать количество используемой сыворотки пропорционально тому разведению ее, которое произошло при предыдущих исследованиях. Если тесты проводились с сухими осадками эритроцитов, то происходит небольшое разведение. Напротив, тест-система сильно разводится, если реакции проводились с суспензиями эритроцитов (а не с сухими каплями). Соответственно, положительные реакции в контрольных тестах должны указывать, что произошедшее разведение сыворотки не повлекло за собой полную утрату специфической активности.

Модификацию этого метода можно использовать и при постановке непрямой реакции Кумбса, для этого пробы после инкубации сухих капель эритроцитов и сыворотки центрифугируют и тщательно собирают сыворотку перед отмыванием отдельно из каждой пробирки. Их нельзя смешивать до учета результатов, поскольку для повторного использования пригодна сыворотка, снятая с отрицательных проб (не следует собирать сыворотки из тех проб, в которых получены положительные результаты - во всех них имела места адсорбция антител, повторное их использование может привести к ложноотрицательным результатам в силу указанной причины).

Сложнее собрать сыворотку после выполнения тестов в методе с наслаиванием альбумина или при использовании энзимов, однако можно собрать сыворотку после проведения реакций с эритроцитами, предварительно обработанными ферментами.

Как уже отмечено выше, сыворотку собирают только из тех проб, в которых получены отрицательные результаты. Не следует собирать сыворотки даже после получения в них слабоположительных реакций - в этих случаях также происходит адсорбция и существенное истощение специфической активности антител.

Приготовление реагентов

0, 15М KH₂PO₄ Растворите 20, 4 г сухой соли в дистиллированной воде, доведите объем до 1 л. Храните при 4^оС, если появились признаки бактериального загрязнения или плесень - раствор непригоден.

0, 15М Na₂HPO₄ Растворите 21, 3 г сухой соли в дистиллированной воде, доведите объем до 1 л, условиях хранения раствора точно такие же, что и для калиевой соли.

Также необходимы Глицин и NaCl

Приготовление раствора LISS

1.Растворите 1, 75 г NaCl и 18, 0 г глицина приблизительно в 600мл дистиллированной воды.

2.Добавьте 11, 3 мл 0, 15 М раствора калиевой соли и 8, 7 мл 0, 15 М натриевой.

3.Доведите объем до 1 литра, используя дистиллированную воду.

4.Проверьте рН и откорректируйте его при необходимости используя 1н раствор NaOH.

5.Храните раствор при 4^оС.При появлении признаков бактериального загрязнения, помутнения или плесени последний непригоден.

Трипсин

Тип III, 2X, кристаллизованный, 10-13 тыс.ед на 1 мг протеина, Sigma Chemical Company, St.Louis, Missouri.

Папаин

Тип II, неочищенный порошок, приблизительная активность от 1, 6 до 2, 8 ед.в 1 мг порошка, Sigma Chemical Company, St.Louis, Missouri.

Порошок папаина

Difco Laboratories, Detroit, Michigan

Фицин

Неочищенный порошок фицина 0, 05 - 0, 15 ед.на 1 мг порошка, , Sigma Chemical Company, St.Louis, Missouri.

Порошок фицина

1000 ед.в 1 грамме порошка, Grand Island Biological Company, Grand Island, New York, USA.

Поскольку энзимированные эритроциты весьма чувствительны в отношении холодовых агглютининов, не имеющих клинического значения, ряд авторов обращают на это особое внимание и призывают использовать ферменты в возможно низких концентрациях. Это полезно лишь в некоторой степени. Существенное занижение концентрации используемых ферментов может повлечь за собой и существенное снижение проводимых серологических тестов. Таким образом, смысл применения энзимов теряется при использовании их в излишне малых концентрациях. Как будет описано далее, степень разрушения таких эритроцитарных антигенов как Fy^a и Fy^b коррелируют со специфической активности ферментов.

Двухэтапный метод с фицином

1.Разведите 1 объем 1% раствора до концентрации 0, 1 % или 0, 05% добавив к нему (9 или 19 соответственно) объемов изотонического раствора, забуференного до 7, 3. Полученный раствор далее используется в качестве рабочего для предварительного энзимировании клеток.

2.К одному объему отмытых и плотно упакованных эритроцитов добавляют равный объем рабочего раствора фицина.

3.Инкубируйте при 37^оС в течение 15-30 минут.

4.Отмойте энзимированные эритроциты 3 раза.

5.Используйте 2-5% взвесь энзимированных эритроцитов подобно любому другому эритроцитарному диагностикуму.

Замечания

1.Фицин, разумеется, самый мощный из 4 предложенных энзимов (трипсин, папаин, бромелин, фицин), используемый в рутинной практике иммуногематологами. Опыт некоторых исследователей указывает на определенные затруднения, возникающие при работе с 0, 1% раствором фицина в плане обнаружения с высокой частотой холодовых агглютининов, не имеющих никакого клинического значения. В этой связи они предпочитают использовать 0, 05% рабочие растворы вместо 0, 1%. Более слабые концентрации следует использовать только в тех случаях, когда возникли проблемы при использовании 0, 1% рабочего раствора фицина.

2.Было замечено, что аутоадсобрция (техника процедуры описана выше) весьма эффективна, если аутоэритроциты обработаны высокими концентрациями фицина, для этих целей клетки энзимируют с использованием даже 1% раствора фицина. Однако этот метод не следует использовать для энзимирования панели клеток при идентификации антител - вы рискуете вообще не получить ни одного отрицательного результата с эритроцитами, энзимированными раствором фицина столь высокой концентрации. Можно также добавить, что указанный метод весьма эффективен для удаления холодовых агглютининов типа анти-I, он неэффективен для удаления холодовых агглютининов со специфичностью анти-Sp, -Pr, поскольку указанные антигены разрушаются под действием фицина.

Маточные буферные растворы

0, 1М Na2HPO4 Растворите 14, 2 г сухой соли в 1000 мл дистиллированной или деминерализованной воды.

0, 1M KH2PO4 Растворите 13, 6 г сухой соли в 1000 мл дистиллированной или деминерализованной воды.

Таблица Пропорциональные соотношения маточных буферных растворов для приготовления растворов с различными значениями рН.

количество 0, 1 М количество 0, 1 М рН смеси

натриевой соли калиевой соли

2, 4 97, 6 5, 3

3, 5 96, 5 5, 4

4, 9 95, 1 5, 6

10, 0 90, 0 5, 9

20, 0 80, 0 6, 24

30, 0 70, 0 6, 47

40, 0 60, 0 6, 64

50, 0 50, 0 6, 8

60, 0 40, 0 7, 0

70, 0 30, 0 7, 17

78, 0 22, 0 7, 3

81, 0 19, 0 7, 4

90, 0 10, 0 7, 73

94, 9 5, 1 8, 0

Необходимые материалы

Полибрен (маточный раствор)

Растворите 1 г полибрена в 100 мл 0, 9% растворе NaCl. Храните этот раствор в полимерной таре, поскольку стекло адсорбирует полибрен, поэтому может привести к ослаблению свойств полибрена вызывать аггрегацию.

Рабочий раствор полибрена

Разведите 1 объем 1% маточного раствора в 20 объемах изотонического раствора поваренной соли.

Глюкозо-цитратный раствор

Смешайте 60 мл 0, 2М раствора натрия цитрата трех замещенного с 40 мл с 40 мл 5%раствора D-глюкозы.

Метод

1.Смешайте в пробирке 0, 1 мл (2 капли сыворотки) с достаточным количеством упакованного осадка отмытых эритроцитов, конечная концентрация последних должна составлять приблизительно 0, 5% (см.далее замечания).

2.Добавьте 1, 0 мл LISS, перемешайте содержимое и оставьте пробы на 1 минуту при комнатной температуре.

3.Добавьте 0, 1 мл (2 капли) рабочего раствора полибрена и перемешайте, оставьте пробы на 15 секунд при комнатной температуре.

4.Центрифугируйте пробы при 1000g в течение 10 секунд.

5.Удалите весь супернатант, свободный от эритроцитов, осушите внутренность пробирок.

6.Добавьте 0, 1 мл глюкозо-цитратного раствора во все пробирки.

7.Закрепите пробирки под углом 45^о и осторожно встряхивайте их приблизительно в течение 10 секунд до тех пор, пока аггрегация эритроцитов, обусловленная полибреном не разойдется.

8.Учтите результаты по наличию или отсутствию агглютинации и запишите результаты (см. замечания).

9.Для отрицательных результатов, требующих конверсии в антиглобулиновый тест, добавьте в пробирки по 0, 05 (1 каплю) глюкозо-цитратного раствора.

10.Тщательно перемешайте содержимое пробирок.

11.Отмойте дважды содержимое пробирок раствором, пропись указана выше.

12.Удалите полностью отмывающий раствор, добавьте АГС, центрифугируйте пробы 15 секунд и осторожно встряхивая последние, учтите результаты. Используйте эритроциты, нагруженные IgG для положительного и отрицательного контролей (более детально см. главу 4).

Замечания

1.Сообщалось, что концентрация рабочего раствора для разных лотов полибрена может варьировать слегка вокруг цифры 0, 05%. Оптимальную концентрацию в этих случаях находят методом проб и ошибок. Метод синтеза полибрена опубликован.

2.В качестве тестируемого материала при скрининге антител и постановке претрансфузионных тестов используют неразведенные сыворотки. Когда проводят поиск антиген негативных образцов эритроцитов, тестовые сыворотки могут быть разведены, чем может быть достигнута большая экономия ценных сывороток. Рекомендуется разводить тестовые сыворотки сывороткой АВ группы, адсорбированной от холодовых агглютининов или, лучше 5% раствором нормальной АВ сыворотки в изотоническом растворе (1 объем сыворотки АВ группы смешивают с 19 объемами изотонического раствора).

3.В первой публикации, описывающей метод, сказано, что при необходимости при учете результата может быть применено микроскопирование.

4.Промедление в учете результата после добавления глюкозо-цитратного раствора может привести к ослаблению выраженности положительных результатов вплоть до исчезновения агглютинации (если это продолжается слишком долго). Рекомендовано, чтобы учет результатов проводился в течение 3 минут с момента добавления глюкозо-цитратного раствора. Тесты не должны подвергаться повторному центрифугированию после добавления глюкозо-цитратного раствора и встряхивания, поскольку это приведет к исчезновению положительных результатов.

5.В первой публикации, описывающей эту технику, рекомендовано двукратное отмывание эритроцитов при конверсии теста в непрямой антиглобулиновый. Без сомнения, найдутся исследователи, которые попробуют поэкспериментировать с количеством отмываний - они легко убедятся в том, что чувствительность теста не снизится и после 3- или 4-х отмываний.

6.Каждую серию тестов рекомендуется проводить, выполняя контрольные положительные и отрицательные тесты. Это необходимо для сопоставления выраженности аггрегации, вызываемой полибреном, ее реверсии после добавления глюкозо-цитратного раствора и встряхивания. Контроли, наконец, позволяют судить о том, как выглядят положительные и отрицательные результаты в полибреновом методе на этапах 8 и 12.

ZZAP обработка эритроцитов

В 1980 году Branch & Petz описали использование раствора, содержащего папаин и дитиотрейтол. Был разработан метод обработки эритроцитов больных с наличием тепловых аутоиммунных противоэритроцитарных антител, позволяющий удалить аутоантитела с эритроцитов. Известно, что такие эритроциты крайне сложно фенотипировать с использованием тест-систем на основе IgG антител, поскольку все они демонстрируют ложноположительные реакции. Было показано, что такая обработка эритроцитов приводит к разрушению антигенов M, N, Fy^a, Fy^b и всех антигенов системы Келл. Таким образом, могут быть искусственно получены эритроциты фенотипа Ко (" Келл-нуль" ).

Приготовление раствора ZZAP

1.Приготовьте 0, 2 М раствор дитиотрейтола растворив 1 г сухого вещества в 32, 4 мл забуференного до 7, 3 изотонического раствора.

2.К 2, 5 мл приготовленного 0, 2 М раствора дитиотрейтола добавьте 0, 5 мл 1% раствора активированного папаина (приготовленного по Low как описано выше) и 2, 0 мл изотонического раствора, забуференного до 7, 3. Тщательно перемешайте путем перевертывания. Конечный раствор должен иметь рН между 6, 0 и 7, 0, может храниться при 4^оС в течение 24 часов.

Обработка эритроцитов

1.Упакуйте обрабатываемые эритроциты путем жесткого центрифугирования и отделения супернатанта. В отмывании их нет необходимости.

2.К каждому 1 мл упакованных эритроцитов добавьте по 2 мл раствора ZZAP.

3.Перемешайте содержимое пробирок и инкубируйте их при 37^оС в течение 30 минут.

4.Отмойте 3 раза изотоническим раствором и используйте для аутоадсорбции или в других серологических тестах.

Обработка эритроцитов

1.АЕТ может быть приобретен от Calbiochem-Behring Corporation, San Diego, California, препарат стабилен в сухом состоянии при комнатной температуре.

2.Растворите 6 г АЕТ в 100 мл дистиллированной воды, доведите рН до 8, 0 используя 5N NaOH.

3.Смешайте 1 объем отмытых упакованных эритроцитов с 4 объемами 6% раствора АЕТ.

4.Инкубируйте пробу 20 минут при 37^оС.

5.Отмойте эритроциты изотоническим раствором, забуференным до 7, 0. Отмывание производят до тех пор, пока супернатант не станет полностью прозрачным, во время первых отмываний последний может быть гемолизированным.

6.АЕТ-обработанные эритроциты можно хранить при 4^оС в течение 24 часов.

Заметьте: АЕТ следует готовить непосредственно перед использованием

Адсорбционные тесты

Антитела могут быть удалены из сыворотки с применением метода адсорбции на эритроцитах. Сыворотка, содержащая антитела при этом смешивается с эритроцитами, несущими антиген, против которого направлены антитела. Благодаря образованию комплексов антиген - антитело вся активность последних может быть полностью устранена из адсорбированной сыворотки. Практическое значение этого метода отмечено в главах, посвященных описанию системы АВО, идентификации антител и аутоиммунным антителам. В целом можно отметить, что применение адсорбции является полезным в следующих ситуациях.

1.Отделение антител из сывороток, содержащих одновременно антитела нескольких специфичностей.

2.Подтверждение специфичности антител.

3.Приготовление типирующих реагентов.

4.Подтверждение присутствия на эритроцитах слабо выраженных вариантов тех или иных антигенов.

Поскольку целью адсорбции часто является полное истощение активности антител из сыворотки, при этой процедуре применяются другие соотношения сыворотки и эритроцитов, нежели при выполнении агглютинационных проб.

Весьма хорошим в практическом смысле является равные объемы упакованных эритроцитов и адсорбируемой сыворотки.

Метод адсорбции

1.Отмойте эритроциты, используемые для адсорбции 3 раза большими объемами физиологического раствора.

2.После последнего отмывания тщательно удалите все остатки отмывающего раствора, в противном случае последние приведут к разведению адсорбируемой сыворотки. С этой целью дополнительно центрифугируйте сосуд, в котором проводилось отмывание эритроцитов.

3.Осторожно удалите весь изотонический раствор с упакованных эритроцитов.

4.Добавьте сыворотку в объеме, равном объему упакованных отмытых эритроцитов.

5.Тщательно перемешайте пробу и инкубируйте от 30 до 60 минут при температуре, которая оптимальна для действия удаляемых антител.

6.Центрифугируйте пробу и соберите весь супернатант - адсорбированную сыворотку.

7.Если предполагается проводить элюцию, сохраните эритроциты, на которых проводилась адсорбция.

Контроль адсорбции

Если требуется полная адсорбция антител, сыворотка должна быть проверена на полноту адсорбции антител. Это следует сделать, используя свежезаготовленный образец эритроцитов, на которых производилась адсорбция а также с другими пробами, содержащими соответствующий антиген. Исследование следует проводить методом, обладающим наибольшей чувствительностью для обнаружения данного вида антител. Если сыворотка продолжает реагировать с соответствующими образцами эритроцитов, необходимо продолжать адсорбцию с другими порциями антиген позитивных эритроцитов, если того требует конечная цель эксперимента. Некоторые антитела требуют трех и более адсорбций прежде чем наступит полное устранение их действия. Использование энзимированных эритроцитов часто позволяет сократить число процедур адсорбции, необходимых для полного истощения активности антител. Однако, клетки, обработанные энзимами, нельзя использовать, если ферменты разрушают соответствующие антигены эритроцитов (антигены перечислены неоднократно выше).

Элюция антител

После присоединения антител к эритроцитам как in vivo, так и in vitro, последние могут быть отделены методами элюции. Жидкость, содержащую отделенные антитела, называют элюатом. Метод элюции антител представляется ценным в следующих ситуациях.

1.Идентификация специфичности антител в сыворотках, содержащих антитела к различным эритроцитарным антигенам.

2.Подтверждение специфичности антител.

3.Приготовление типирующих реагентов. Если единственным доступным источником антител, к примеру, является сыворотка O(I) группы, а исследовать необходимо эритроциты группы A(II), сыворотка может быть адсорбирована на антиген позитивных эритроцитах группы O(I), полученный с них элюат не будет содержать анти-А и анти-В антител и, таким образом, может быть получен элюат для последующего использования в качестве универсального типирующего реагента, пригодного для исследования любых образцов эритроцитов независимо от их АВО-принадлежности.

4.Подтверждение присутствия слабо выраженных эритроцитарных антигенов.

5.Идентификация антител, послуживших причиной развития гемолитического заболевания новорожденного (ГБН).

6.Идентификация антител, послуживших причиной развития посттрансфузионной гемолитической реакции.

7.Изучение антител у больных с приобретенной гемолитической анемией.

Элюция антител требует такой диссоциации комплексов антиген - антитело, которая оставляет интактной активные центры антител. Многие методы элюции приводят к разрушению эритроцитов и попаданию в элюат гемоглобина.

Предложено огромное количество методов элюции. Строго говоря, все они могут быть подразделены на 3 группы по своему механизму. Первая из них характеризуется тем, что в ней удается получить холодовые антитела либо антитела с широким диапазоном температурного действия. Эти методы особенно ценны в получении антител с эритроцитов, страдающих ГБН в связи АВО-несовместимостью матери и плода. Вторая группа методов позволяет хорошо выделить тепловые антитела класса IgG не способные вызывать агглютинацию в прямых тестах с эритроцитами, которые могут быть как алло-, так и аутоиммунными по своей природе. Третья группа включает методы, которые позволяют отделить антитела с мембраны эритроцитов и после этой процедуры эритроциты пригодны для последующего фенотипирования с тестовыми сыворотками.

По имеющемуся опыту метод элюции с подогревом по Landsteiner & Miller оправдывает себя в ситуациях, когда выделяются холодовые агглютинины либо антитела с широким температурным диапазоном активности. Метод замораживания-оттаивания по Wiener имеет право на применение, однако он несколько громоздкий и длительный. Согласно данным Judd, метод Lui с быстрым замораживанием и оттаиванием также эффективный в использовании.

Для отделения тепловых антител длительное время применяется эфирный метод. Метод элюции антител со стром эритроцитов с использованием эфира впервые описали Vos & Kelsall, позднее Vos & Rubin показали, что антитела можно отделить и с цельных эритроцитов, в выполнении отдельного этапа по получению их стром нет необходимости. Опыт Вашего автора показывает, что этот метод является быстрым и простым, позволяет получить большие количества аутоантител с эритроцитов больных, которые присоединились к ним in vivo или тепловых аллоиммунных антител, которые сенсибилизировали эритроциты in vitro. В отдельных редких случаях, когда возникают проблемы в выделении аутоантител с эритроцитов больных аутоиммунной гемолитической анемией, весьма ценным методом выбора является элюция с использованием дигитонина. Поскольку правила хранения и обращения с эфиром всегда представляли собой целую бюрократическую проблему (вероятно, в США -примечание мое, В.А.), были разработаны альтернативные методы, позволяющие обойтись без эфира при проведении элюции. Сообщалось, что ксилен и хлороформ действуют столь же хорошо, что и эфир. Аналогичным образом была предложена и кислотная элюция на холоду. Несмотря на указанные сообщения об альтернативных методах, Ваш автор использует эфирную элюцию как метод выбора в рутинных ситуациях.

Подбор крови для переливания больным с аутоиммунной гемолитической анемией, обусловленной тепловыми антителами всегда является проблемой. Поскольку действие аутоантител (часто реагирующих сильно со всеми образцами эритроцитов стандартизованной панели) может маскировать присутствие аллоиммунных антител, необходимым условием является адсорбция аутоантител. С этой целью проводится аутоадсорбция, в процессе ее должно быть устранено действие аутоантител, но не аллоиммунных антител. Идеальным является использование для аутоадсорбции собственных эритроцитов больного. Однако, они нередко демонстрирую положительные реакции с силой 4+ в прямом тесте Кумбса и не способны связать дополнительное количество аутоантител. Одним из путей разрешения проблемы удаления антител с эритроцитов является метод Stratton & Renton, который позднее модифицировал Morrel в котором удается добиться частичной элюции аутоантител с помощью подогрева без разрушения эритроцитов. Позднее Edwards и соавт. описали использование хлороквина для элюции антител с эритроцитов с одновременным сохранением последних для адсорбции.

Как уже отмечено выше, существует много методов элюции. Ваш автор описывает те, которые использовались им на практике и показали свою эффективность. Это вовсе не означает, что следует пользоваться только теми, которые описываются далее. Возможно использование также и других существующих техник.

Некоторые исследователи считают, что элюция антител в изотонический раствор делает элюаты нестабильными для хранения и поэтому предпочитают элюировать антитела с эритроцитов в сыворотку группы АВ или 6% бычий альбумин. Если элюат исследуется в день его приготовления, то вполне можно элюировать антитела в изотонический раствор. Однако, если последующие исследования предполагается выполнить позднее и предполагается хранения элюата, то целесообразнее использовать именно эти среды. Другой важнейшей проблемой является качественное выделение только тех антител, которые действительно специфически связаны с эритроцитами. По этой причине процедуре элюции во всех случаях предшествует тщательное 6-кратное отмывание эритроцитов. Полезным является параллельный (одновременно с исследованием элюата) контроль наличия антител в последнем (полученным после 6-го отмывания) отмывающем растворе, который во всех случаях должен быть отрицательным. Только в этом случае можно с уверенностью утверждать, что любая активность элюата обусловлена антителами, которые до процедуры действительно были фиксированы на эритроцитах.

Элюция методом подогрева по Lansteiner & Miller

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К упакованным отмытым эритроцитам добавьте равный объем изотонического раствора (сыворотки АВ или 6% бычьего альбумина)

4.Поместите пробирку на водяную баню при 56^оС на 10 минут. В течение 15 секунд на протяжении каждой минуты интенсивно болтайте пробирку в воде.

5.Центрифугируйте пробирку в жестком режиме однократно. Идеально, если центрифуга с подогревом. В стаканчики центрифуги можно налить горячую (56^оС) воду.

6.Соберите элюат (супернатант, загрязненный гемоглобином).

Замечания.

1.Одно время думали, что если элюат охлаждается, то элюированные антитела быстро вновь фиксируются на строме эритроцитов. Последующие исследования показали, что этот процесс происходит достаточно медленно и практически не влияет на активность полученного элюата.

2.Если не удается получить активные элюаты, то увеличивают силу подогрева. Иногда для элюирования антител подогрев до 60^оС и даже до70^оС более эффективен, нежели до 56^оС.

Ультразвуковая элюция

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К каждому объему отмытых упакованных эритроцитов добавьте половинный объем 6% бычьего альбумина.

4.Поместите каждую из пробирок на ультразвуковую баню (можно приобрести ее в Scientific Products, American Hospital Corp., Miami).

5.Держите пробирки на ультразвуковой бане по меньшей мере в течение 1 минуты или до тех пор, пока не наступит полный гемолиз эритроцитов.

6.Центрифугируйте пробы в течение 5 минут при 1000g.

Эфирная элюция по Rubin

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К отмытым упакованным эритроцитам добавьте равный объем изотонического раствора и перемешайте.

4.Добавьте эфир в объеме, равном содержимому пробирки (эритроциты+ изотонический раствор)

5.Закройте пробирку и перемешивайте путем перевертывания в течение 1 минуты. Осторожно удалите пробку для высвобождения избыточного количества испаряющегося эфира несколько раз в процессе перемешивания.

6.Инкубируйте пробу в течение 30 минут при 37^оС слегка прикрыв пробирку пробкой.

7.Центрифугируйте при 1000g в течение 10 минут.

8.Пробирка должна содержать 3 слоя - верхний слой (чистый эфир), средний (строма эритроцитов) - донный (элюат, загрязненный гемоглобином).

9.Удалите и отбрость2 верхних слоя.

10.Перенесите элюат в другую пробирку.

11.Инкубируйте элюат в незакрытой пробирке при 37^оС для удаления оставшегося эфира в течение 15 минут или дольше.

Замечания

1.Этап 6 может быть опущен, однако элюат будет более активным, если его выполнить.

2.Во время инкубации пробирка должна быть закрыта во избежании испарения эфира. Однако, если пробирка закрыта слишком плотно, она может разорваться. Обычный способ разрешения этой проблемы заключается в том, что пробирку закрывают резиновой пробкой, через которую пропущена тонкая игла. Такое устройство предотвращает повышение давления, связанное с выраженным испарением эфира, но при этом не влияет на его элюирующий эффект.

Элюция с дигитонином

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К 1, 0 упакованных отмытых эритроцитов добавьте 9, 0 изотонического раствора.

4.Добавьте 0, 5 мл 0, 5% раствора дигитонина (производитель - JT Baker Chemical Company, Pittsburg или Calboichem-Behring, San Diego)

5.Перемешивайте перевертыванием по меньшей мере 1 минуту, пока не наступит гемолиз эритроцитов.

6.Центрифугируйте пробу в течение 5 минут при 1000g, отбросьте супернатант.

7.Отмойте строму эритроцитов 3 раза при 1000g в течение как минимум 2 минут при каждом отмывании, убедитесь, что она каждый раз хорошо осела на дно пробирки.

8.К трижды отмытому осадку стромы эритроцитов добавьте 2, 0 0, 1М раствора глицина с рН 3, 0.

Указанный раствор получают путем растворения 3, 754 г глицина в 500 мл дистиллированной воды и доведением рН до 3, 0 с использованием 12н HCl.

9.Перемешивайте содержимое пробирки путем перевертывания в течение 1 минуты.

10.Центрифугируйте пробирку при 1000g в течение 5 минут.

12 3 4 5 6 Следующая ⇒