Элюция замораживанием-оттаиванием по Wiener

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 6Следующая ⇒

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.Плотно закройте пробирку с упакованными эритроцитами и поместите ее в морозильник.

4.После замерзания пробы поместите ее для оттаивания при комнатной температуре.

5.Повторите этапы 2 и 3 до тех пор, пока не наступит полный гемолиз эритроцитов.

6.К разрушенным эритроцитам добавьте 10-кратный объем 50% этилового спирта, предварительно охлажденного до -6^оС.

7.Тщательно перемешайте содержимое и поместите на 1 час в морозильник.

8.Центрифугируйте пробу 5 минут при 1000g.

9.Удалите алкоголь из депозита.

10.Отмойте депозит один раз дистиллированной водой (возможно его придется ломать стеклянной или другой палочкой).

11.Удалите весь супернатант дистиллированной воды после отмывания.

12.Добавьте сыворотку АВ или изотонический раствор в объеме, равном первоначальному объему упакованных эритроцитов.

13.Хорошо перемешайте (разбейте депозит, если необходимо, еще разок).

14.Инкубируйте 1 час при 37^оС.

15.Центрифугируйте сильно и соберите супернатант (элюат). Он может быть чистым или коричневым из-за загрязнения дериватами гемоглобина.

Быстрая элюция замораживанием по Lui

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.Расфасуйте отмытые упакованные эритроциты по 0, 5 мл в пробирки размером 13× 100 мм.

4.Добавьте по 3 капли изотонического раствора в каждую пробирку, закройте пробирки пробками и тщательно перемешайте.

5.Поворачивайте пробирки таким образом, чтобы содержимое покрыло их стенки изнутри.

6.Заморозьте содержимое пробирок в морозильнике при температуре от -20 до -70^оС, пробирки должны находиться в горизонтальном положении.

7.Оставьте их замороженными на 10 минут.

8.Быстро оттаивайте пробирки под струей горячей воды.

9.Соберите содержимое пробирок и центрифугируйте при 1000g в течение 2 минут.

10.Соберите супернатант - элюат.

Ультразвуковая элюция

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К каждому объему отмытых упакованных эритроцитов добавьте половинный объем 6% бычьего альбумина.

4.Поместите каждую из пробирок на ультразвуковую баню (можно приобрести ее в Scientific Products, American Hospital Corp., Miami).

5.Держите пробирки на ультразвуковой бане по меньшей мере в течение 1 минуты или до тех пор, пока не наступит полный гемолиз эритроцитов.

6.Центрифугируйте пробы в течение 5 минут при 1000g.

Эфирная элюция по Rubin

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К отмытым упакованным эритроцитам добавьте равный объем изотонического раствора и перемешайте.

4.Добавьте эфир в объеме, равном содержимому пробирки (эритроциты+ изотонический раствор)

5.Закройте пробирку и перемешивайте путем перевертывания в течение 1 минуты. Осторожно удалите пробку для высвобождения избыточного количества испаряющегося эфира несколько раз в процессе перемешивания.

6.Инкубируйте пробу в течение 30 минут при 37^оС слегка прикрыв пробирку пробкой.

7.Центрифугируйте при 1000g в течение 10 минут.

8.Пробирка должна содержать 3 слоя - верхний слой (чистый эфир), средний (строма эритроцитов) - донный (элюат, загрязненный гемоглобином).

9.Удалите и отбрость2 верхних слоя.

10.Перенесите элюат в другую пробирку.

11.Инкубируйте элюат в незакрытой пробирке при 37^оС для удаления оставшегося эфира в течение 15 минут или дольше.

Замечания

1.Этап 6 может быть опущен, однако элюат будет более активным, если его выполнить.

2.Во время инкубации пробирка должна быть закрыта во избежании испарения эфира. Однако, если пробирка закрыта слишком плотно, она может разорваться. Обычный способ разрешения этой проблемы заключается в том, что пробирку закрывают резиновой пробкой, через которую пропущена тонкая игла. Такое устройство предотвращает повышение давления, связанное с выраженным испарением эфира, но при этом не влияет на его элюирующий эффект.

Элюция с дигитонином

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К 1, 0 упакованных отмытых эритроцитов добавьте 9, 0 изотонического раствора.

4.Добавьте 0, 5 мл 0, 5% раствора дигитонина (производитель - JT Baker Chemical Company, Pittsburg или Calboichem-Behring, San Diego)

5.Перемешивайте перевертыванием по меньшей мере 1 минуту, пока не наступит гемолиз эритроцитов.

6.Центрифугируйте пробу в течение 5 минут при 1000g, отбросьте супернатант.

7.Отмойте строму эритроцитов 3 раза при 1000g в течение как минимум 2 минут при каждом отмывании, убедитесь, что она каждый раз хорошо осела на дно пробирки.

8.К трижды отмытому осадку стромы эритроцитов добавьте 2, 0 0, 1М раствора глицина с рН 3, 0.

Указанный раствор получают путем растворения 3, 754 г глицина в 500 мл дистиллированной воды и доведением рН до 3, 0 с использованием 12н HCl.

9.Перемешивайте содержимое пробирки путем перевертывания в течение 1 минуты.

10.Центрифугируйте пробирку при 1000g в течение 5 минут.

11.Перенесите супернатант в чистую пробирку добавьте 0, 2 мл фосфатного буфера со значением рН 8, 2.

Буферный раствор готовят путем растворения 109, 6 натриевой соли и 3, 8 калиевой соли в 1 литре, добиваются указанного значения рН путем добавления в зависимости от полученного значения 1н NaOH или 1н HCl. Этот раствор может кристаллизоваться при 4^оС, следует добиться растворения осадка, подогревая его при 37^оС.

12.Перемешайте элюат и буферный раствор и центрифугируйте пробирку при 1000g в течение 2 минут.

13.Соберите супернатант.

Элюция с ксиленом

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.В большой пробирке смешайте равные объемы упакованных эритроцитов и изотонического раствора, затем добавьте 2 объема ксилена (его должно быть в 2 раза больше по объему в сравнении со смесью эритроциты+ изотонический раствор).

4.Инкубируйте пробу при 56^оС в течение 10 минут периодически покачивая.

5.Центрифугируйте в течение 10 минут при 1000g.

6.Осторожно удалите верхние слои ксилена и стромы эритроцитов не допуская загрязнения элюата (он загрязнен гемоглобином) стромой.

Элюция с хлороформом

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.В большой пробирке смешайте равные объемы упакованных эритроцитов и 6% бычьего альбумина, затем добавьте 2 объема хлороформа.

4.Закройте пробирку корковой пробкой и осторожно перемешивайте содержимое пробирки в течение 75 секунд.

5.Удалите корковую пробку и инкубируйте пробирку при 56^оС в течение 5 минут стирая со стенок содержимое пробирки.

6.Центрифугируйте пробирку в течение 5 минут при 1000g.

Холодовая кислотная элюция

1.Отмойте эритроциты 6 раз большими количествами изотонического раствора.

2.Сохраните 6-й раствор для параллельного исследования.

3.К 1 объему отмытых упакованных эритроцитов добавьте равный объем изотонического раствора, охлажденного до 4^оС и 2 объема 0, 1М раствора глицина, также охлажденного до 4^оС.

0, 1М раствор глицина готовят путем растворения 3, 754 г глицина гидрохлорида и 2, 922 г в дистиллированной воде, объем раствора доводят до 500 мл, рН доводят до 3, 0 используя 12н HCl.

4.Смешивают внесенные компоненты и помещают пробу на ледяную баню на 1 минуту.

5.Центрифугируют пробу при 1000g в течение 2-х минут.

6.Переносят элюат- супернатант в чистую пробирку и добавляют по 0, 1 мл фосфатного буферного раствора на каждый 1, 0 мл элюата (техника приготовления фосфатного буферного раствора описана выше).

7.Перемешивают элюат с буфером и центрифугируют пробу при 1000g в течение 2 минут.

8.Собирают супернатант- элюат.

Приготовление 6% бычьего альбумина

6% раствор альбумина может быть приготовлен путем смешивания 2, 0 мл 30% бычьего альбумина с 8, 0 мл физиологического раствора.

⇐ Предыдущая 1 2 345 6 Следующая ⇒