История развития геномных исследований. Геномная революция конца XX века.

История развития геномных исследований. Геномная революция конца XX века.

Геномика – раздел биологии, посвящённый исследованию структуры, а также механизмов функционирования и изменчивости геномов.

Геном – совокупность всех молекул ДНК организма.

История геномики:

1866 – законы Менделя.

1869 – открытие ДНК.

1910 – хромосомная теория.

1953 – структура ДНК.

1961 – расшифровка генетического кода.

1972 – клонирование ДНК.

1977 – секвенирование (Frederick Sanger).

1982 – фаг λ, GenBank.

1983 – ПЦР.

1986 – Автоматический секвенатор.

1988 – пиросеквенирование.

1995 – геном бактерии (Крейг Вентер) Haemophilus influenzae.

1996 – геном дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

1998 – геном нематоды Caenorhabditis elegans.

1999 – геном дрозофилы Drosophila melanogaster.

2000 – геном растения.

2003 – геном человека.

2004 – геномный секвенатор.

2007 – синтез генома.

2010 – синтетический организм. Второй расшифрованный Вентером геном – Mycoplasma genitalium.

2014 – нанопоровое севенирование.

Ну, и наконец есть аминотехнология называемая ловушка для интронов, которая позволяет определить, где в последовательности присутствуют экзоны.

Соответствующий вектор должен иметь начальный и конечный экзон, старт-, стоп-кодоны и какой-то интрон. Должно быть 2 интрона, но можно сказать один. В интроне есть сайт рестрикции, который клонирует случайные фрагменты генома ДНК, они могут искажать либо не искажать картину. Затем это конструкция, которая экспрессируется, вводится в эукариотическую клетку, где идет транскрипция. Выделяются транскрипты, которые естественно в живой клетки подвергаются сплайсингу. И в тех случаях, когда здесь нет интронов мы получаем короткий экспрессируемый транскрипт, а где есть интрон – размер транскрипта экспрессируемого увеличивается. Затем идет обратная транскрипция и ПЦР с праймерами, которые отжигаются с известной последовательностью т.е экзонами вектора. Затем продукты ПЦР разгоняются на геле и, если экзона нет – мы получаем короткий продукт, если есть, то ПЦР продукт больше. Мы получаем информацию относительно размера экзона и легко можно найти этот экзон, вставляемый в прогресс. Хотя наиболее информативным является это поиск секвинирования и всех доступных программ этого организма. Работает машина, потом все обрабатывается и получается информация.

Теперь несколько слов о компьютерных программах, которые делают тоже самое, но без участия человека, определяют кодирующая последовательности чисто на основании анализа последовательности генома. Значительная часть программ используют так называемые нейронные сети. Эти компьютерные алгоритмы моделируются по соответствию, как наш, человеческий мозг работает. Под нейронами в компьютер. программе подразумевают логические ячейки. Человеческий нейрон – это, собственно говоря, живой транзистор т.к на вход поступают какие-то импульсы, а на выходе импульс либо есть, либо нет.

Принцип действия, достоинства и недостатки геномных секвенаторов второго поколения, использующих реакцию пиросеквенирования.

Недостатки

1. Небольшой прирост длины прочтения;

2. Требует увеличения времени в 3 раза;

3. Проблемы с гомополимерными повторами остаются.

Принцип действия, достоинства и недостатки геномных секвенаторов второго поколения, использующих ДНК-полимеразную реакцию (секвенирование путем синтеза, Illumina

Принцип: детекция флуоресцентных присоединяемых ДНК-полимеразой нуклеотидов.

Геномные секвенаторы третьего поколения, использующие технологию SMRT (Pacific Biosciences): принцип действия, преимущества и недостатки.

Регистрация прохождения ионов через пору.

Нанопоровые геномные секвенаторы третьего поколения (Oxford Nanopore): принцип действия, преимущества и недостатки.

Варианты нанопор:

Органическая (белковая нанопора в липидной мембране);

Гибридная: белковая нанопора в полимерной мембране;

Неорганическая: (графен +SiN_x или SiO₂);

Экзонуклеаза отщепляет нуклеотиды, которые проходят через пору (плохо, т. к. нуклеотиды теряются);

С помощью хеликазы одноцепочечная ДНК проходит через пору.

Принцип работы

Нанопоровые системы представляют собой реакционную камеру, внутри которой находится раствор электролита. Камера разделена на две части липидной мембранной или иной тонкой непроводящей поверхностью, в которую внедрена единичная нанопора. К частям камеры прикладывают напряжение, из-за чего возникает ток ионов через пору. Когда исследуемые молекулы проходят через пору по направлению поля, они уменьшают сечение, доступное для ионов, и сила тока падает. Анализируя изменение силы тока, можно определить свойства молекулы, проходящей через пору.

В случае нуклеиновых кислот, диаметр используемых нанопор составляет несколько нанометров, из-за чего ДНК и РНК способны проходить сквозь пору только в одноцепочечной форме, но не в двухцепочечной. При прохождении молекулы нуклеиновой кислоты через пору отдельные нуклеотиды задерживаются в определенных сайтах внутри поры, в результате чего происходит измеримое падение силы тока.