Геномные проекты. Иерархический и шотган-подход. Фазы геномного проекта.

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 8Следующая ⇒

Ограниченные возможности методов секвенирования ДНК предопределяют дополнительные шаги, необходимые для определения последовательностей геномов:

1. Конструирование геномных библиотек – источников фрагментов ДНК для секвенирования;

2. Картирование ДНК: составление подробной карты генома и определение позиций фрагментов из библиотеки на этой карте;

3. Секвенирование отобранных из библиотеки клонов;

4. Компьютерная сборка генома из отрезков;

5. Финиширование: секвенирование остающихся пробелов;

6. Аннотация геномной последовательности.

Первая стадия которая присутствует всегда, пока не дошли до методик третьего поколения, это конструирование геномных библиотек – тех фрагментов ДНК что используются для секвенирования. Есть два варианта конструирования этих библиотек – in vivo, что характерно для методик первого поколения, и in vitro – прямо по ходу секвенирующей реакции, что характерно для методик второго поколения. Вроде бы удобнее второй подход, но у первого есть свои преимущества, поскольку созданные in vivo библиотеки можно использовать и для других вещей. В частности для картирования геномов. Картирование геном на сегодняшний момент – единственный способ, который гарантирует высокое качество определяемых последовательностей, характерно то что не укорачиваются никакие из кусков генома, гарантирует то что не произошло реорганизации последовательности т.е. перестановки их местами и в целом наличие хорошей целой карты четко показывает качество собранной последовательности. После того как отсеквенировали случайным образом отобранные из библиотеки клоны следующая стадия геномного проекта это сборка последовательностей генома из полученных кусочков, это довольно трудный процесс и с секвенаторами второго поколения которые огромное количество коротеньких фрагментов. Это занимает несколько дней на очень высокой производительности современных компьютеров. Это действительно сложный процесс. И следующий этап это стадия финиширования, которая может называться по-разному, но суть сводится к тому что при любом подходе к секвенированию всегда остаются после сборки какие-то неопределенные, недосеквенированные последовательности. На стадии финиширования эти пробелы нужно закрыть, найти пропущенную последовательность и секвенировать еще раз. И самая последняя стадия, но которая на самом деле имеет биологический смысл, это аннотация геномных последовательностей – мало получить длинную цепочку, нужно еще выяснить что эта цепочка обозначает. Законченная геномная последовательность в обязательном порядке содержит аннотацию, в которой расписано где располагаются гены, что они могут кодировать, как они могут регулироваться и т.д. Когда последовательность аннотирована ей удобно пользоваться.

Иерархический и шотган-подходы к секвенированию имеют свои достоинства и недостатки:

Качество получаемой последовательности значительно выше при иерархическом подходе.

Трудоёмкость и стоимость ниже при шотган-подходе.

Секвенаторы второго поколения (геномные секвенаторы) автоматически предполагают использование шотган-подхода (и более низкое качество получаемой последовательности).

Организован геномный проект может быть по разному.

Есть два принципиально разных подхода к организации геномных проектов. Различия между ними в том каков масштаб секвенирования и какой последовательности перечисленные выше стадии вовлекаются в геномный проект. Иерархический это традиционный подход, с которым были определены последовательности первого бактериофага еще в лаборатории Сенгера и который на самом деле использовался при секвенировании генома человека. Шотган подход более удобен с определенных точек зрения, он более технологичен, получается все дешевле, но сиквенс получается более низкого качества. Давайте посмотрим последовательность событий.

В любом случае первым шагом как при том подходе, так и при этом является конструирование геномных библиотек, очень удобно получать набор фрагментов, которые в дальнейшем будут использоваться для секвенирования. Ну давайте сначала разберемся с шотган подходом. При методе дробовика начинается массовое секвенирование случайных клонов. Здесь речь идет о том, что нужно многократно отсеквенировать одну и ту же часть генома, чтобы с достаточной уверенностью можно было говорить о том, что мы большую часть генома накрываем. В бактериальных геномах речь идет где-то о перекрытии раз в 8-10, во столько раз больше проходит секвенирование что гарантирует 98-99% перекрытие. Для эукариотических геномов речь идет обычно о 15-20 кратном перекрытии, для генов позвоночных в частности. После того как этот огромный набор фрагментов получен идет компьютерная сборка перекрывающихся участков тех или иных фрагментов. И тут выясняется что осталась куча дырок. И с вот этими дырками приходится разбираться, причем после секвенирования прокариотических геномов остается несколько десятков иногда до сотни этих пробелов. При секвенировании эукариотических геномов до десятков тысяч остается этих пробелов. И приходится уже разбираться почему эти участки остались недосеквенированными и находить соответствующие последовательности в геномных библиотеках этих либо делать новые геномные библиотеки. Вот для этого подхода секвенирования это самая трудоемкая стадия которая занимает больше всего времени, больше ресурсов требует и самая дорогостоящая стадия. Следующая стадия, когда пробелы уже ликвидированы - аннотация геномной последовательности.

При иерархическом подходе после получения геномной библиотеки идет физическое картирование генома и одновременно подбираются те клоны которые необходимы для секвенирования. Здесь критичным является построение физической карты. Поскольку именно эта стадия гарантирует высокое качество собранной геномной последовательности, потому что берется не случайный клон, а берутся последовательно перекрывающиеся клоны и мы заранее знаем что у нас геномная последовательность перекрыта полностью. На этой стадии мы получаем гарантию что ничего не потерялось, что мы последовательно друг за другом эти кусочки секвенировали. Очень низкая вероятность того что будут неправильно состыкованы клоны. Здесь масса плюсов но это очень трудоемкая процедура и при таком подходе больше времени будет на вот эту стадию. Потом отобранные клоны секвенируются здесь уже нет перекрытия поэтому стадия секвенирования менее масштабна. В любом случае даже при шотган подходе все равно дешевле, чем та стадия где больше ручной работы. Вот здесь это стадия секвенирования отобранных клонов, в шотган подходе это стадия финиширования. Именно эти стадии определяют стоимость определения последовательности генома. Последней стадией при классическом иерархическом подходе также аннотация геномной последовательности.

На самом деле четко нужно знать 2 вещи: то что качество получаемой геномной последовательности получается высоким только при иерархическом подходе. Не просто выше, а значительно выше. И это на сегодняшний день единственный способ получить последовательность позвоночного животного ближайшего качества. Для геномов размер которых составляет миллиарды нуклеотидных пар это единственный подход, который гарантирует такое качество. Но с другой стороны трудоемкость и стоимость ниже по шотган подходу, у нас нет ресурсов чтобы все геномы подряд секвенировать по вот этой трудоемкой технологии. Поэтому как все организуется? В одной таксономической группе один эталонный геном определяется при использовании такого подхода, а все прочие при помощи шотган подхода и сборка последовательностей идет с использованием информации о близкородственном геноме, тогда ошибок гораздо меньше получается и шотган оказывается оправданным. Все больше и больше получающие сейчас распространение секвенаторы второго поколения. Они сразу направляют процесс секвенирования по шотган пути т.к. иерархический подход требует конструирование геномных библиотек in vivo, если нет библиотеки невозможно построить физическую карту. Без физической карты остается только шотган подход т.е. секвенатор второго поколения изначально ориентирован на более низкое качество сиквенса, то что протяженность прочтения получается короче еще больше снижает это качество и реально получается что эти машины предназначены для поиска мутаций.

Вот есть стандартный результат шотгана эукариотического генома. И вот эти фрагменты - это непрерывные фрагменты состыкованной последовательности, которая называется особым термином контиги. Размер этих контиг варьирует в зависимости от того насколько интенсивно был шотган, от пару 10.000 н.п.

Есть пробелы, их 2 типа, есть пробел секвенирования. Речь идет о том, что бак не секвенирован до конца, ну потому что случайно фрагментируется бак последовательность и случайно идет сиквенс. То есть вот эти кусочки, мы знаем где они есть, они на конкретной бак последовательности. Можно взять этот бак и просеквенировать куски до конца вдоль этой линии. То есть эти пробелы тоже закрываются. Есть еще физические пробелы, когда у нас между соседними группами контиг, даже не известно, где этот фрагмент в геноме стоит. Просто нет нуклеотид - соответствующего клона, который позволяет стыковать все эти фрагменты между собой. Вот в такой ситуации если финансирование проекта уже закончилось, база данных подается в наборе таких фрагментов, поскольку известно что фрагменты одного непрерывного фрагмента они так и подаются. Scaffold можно переводить как остов, скелет, каркас – основа окончательной геномной последовательности. Этот фрагмент имеет 100000 п.н., но в каждом из этих остовов будут считать пробелы. И значительная часть эукариотических геномов к сожалению попадают в базу данных в таком виде, но это гораздо лучше, чем не иметь этой последовательности вообще. Потом когда технологии секвенирования стали совершенствоваться это все досеквенируется до конца. Нужно работать с конкретным геном, который тут расположен и сама лаборатория, которая с этим геном работает может эти пробелы открыть, в принципе очень сложно.

Векторы – приспособленные для клонирования чужеродных фрагментов ДНК молекулы, имеющие в своём составе:

1. Ori;

2. Селективный маркер (ген антибиотикорезистентности);

3. Рестрикционные сайты, удобные для клонирования;

Также могут входить в вектор:

1. Гены, контролирующие распределение копий вектора между дочерними клетками (для низкокопийности векторов);

2. Теломерные концы.

Векторы:

1. Плазмиды;

2. Фаги;

3. Космиды;

4. YAC.

Космиды:

Содержит cos-сайт λ (позволяет упаковать космиду в головку бактериофага);

Ori-сайт в E. coli. Несёт ген антибиотикорезистентности;

Обладает повышенной ёмкостью;

Нет проблем с токсичностью.

Содержат центромеру и теломеру.

⇐ Предыдущая 123 4 5 6 7 8 Следующая ⇒