Принцип действия, достоинства и недостатки геномных секвенаторов второго поколения, использующих детекцию протонов (Ion Torrent)

⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 8Следующая ⇒

Метод основан на связи между химической и цифровой информацией, что позволяет быстрее и проще секвенировать большое количество образцов. Эта технология также называется рН-индуцированным секвенированием. Процесс основан на детекции протонов, которые получаются при синтезе цепи ДНК как побочный продукт. Как следствие, рН раствора меняется, что и можно детектировать.

Платформа Ion Torrent отличается от остальных технологий секвенирования тем, что в ней не используются модифицированные нуклеотиды и оптические методы. Метод Ion Torrent позволяет исследовать транскриптомы, малые РНК, проводить ChIP-seq. Более того, с его помощью можно изучать геномы микробных сообществ.

В сущности, Ion Torrent-чип представляет собой очень чувствительный pH-метр. Каждый чип содержит миллионы ион-чувствительных полупроводниковых транзисторных (ion-sensitive field-effect transistor, ISFET) сенсоров, позволяющих параллельную детекцию множества секвенирующих реакций (Rothberg et al, 2011). Достоинствами полупроводниковой технологии являются: сравнительно низкая цена производства приборов, чипов и реагентов; быстрый процесс секвенирования; масштабируемость системы.

Принцип: детекция флуоресценции присоединенных ДНК – полимеразой нуклеотидов.

Длина читаемой последовательности - 100 н. п.

Кол-во одновременных реакций – 2 млрд.

Продолжительность рабочего цикла - 8 дней.

Кол-во оснований в сутки – 25 млрд н. п.

Реакция проходит в центре прибора (в проточной камере с 8 каналами).

1) фрагменты ДНК иммобилизуются на поверхности проточной камеры, затем амплифицируются при помощи ПЦР, в результате чего получают до миллиардов кластеров с идентичными молекулами ДНК в каждом.

2) регистрация включения нуклеотида.

это пошаговая процедура, каждый шаг включает в себя.

а) присоединение нуклеотида с флуоресцентным терминатором.

б) считывание флуоресценции.

в) отсоединение терминатора вместе с флуоресцентной меткой.

3) считывание последовательности ДНК (после присоединения каждого нуклеотида прибор сохраняет изображение флуоресценции всех кластеров проточной камеры, анализ изображений позволяет определить последовательность присоединенных нуклеотидов при копировании каждой матрицы).

Геномные секвенаторы третьего поколения, использующие технологию SMRT (Pacific Biosciences): принцип действия, преимущества и недостатки.

Регистрация прохождения ионов через пору.

Нанопоровые геномные секвенаторы третьего поколения (Oxford Nanopore): принцип действия, преимущества и недостатки.

Варианты нанопор:

Органическая (белковая нанопора в липидной мембране);

Гибридная: белковая нанопора в полимерной мембране;

Неорганическая: (графен +SiN_x или SiO₂);

Экзонуклеаза отщепляет нуклеотиды, которые проходят через пору (плохо, т. к. нуклеотиды теряются);

С помощью хеликазы одноцепочечная ДНК проходит через пору.

Принцип работы

Нанопоровые системы представляют собой реакционную камеру, внутри которой находится раствор электролита. Камера разделена на две части липидной мембранной или иной тонкой непроводящей поверхностью, в которую внедрена единичная нанопора. К частям камеры прикладывают напряжение, из-за чего возникает ток ионов через пору. Когда исследуемые молекулы проходят через пору по направлению поля, они уменьшают сечение, доступное для ионов, и сила тока падает. Анализируя изменение силы тока, можно определить свойства молекулы, проходящей через пору.

В случае нуклеиновых кислот, диаметр используемых нанопор составляет несколько нанометров, из-за чего ДНК и РНК способны проходить сквозь пору только в одноцепочечной форме, но не в двухцепочечной. При прохождении молекулы нуклеиновой кислоты через пору отдельные нуклеотиды задерживаются в определенных сайтах внутри поры, в результате чего происходит измеримое падение силы тока.

⇐ Предыдущая 1 2 3 456 7 8 Следующая ⇒