|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
|
|
Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
Получение и характеристика культур стволовых клетокСтр 1 из 4Следующая ⇒
Самуратова Д. М.
Получение и характеристика культур стволовых клеток ДИПЛОМНАЯ РАБОТА Специальность 5В070100 – Биотехнология Костанай, 2016
Нормативные ссылки
В настоящей дипломной работе использованы ссылки на следующие стандарты: ГОСТ 17299-78 - Спирт этиловый технический. Технические условия. ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия. ГОСТ 19126-79Е - Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия. ГОСТ 20730-75 – Питательные среды. ГОСТ 25336 – 82 Пробирки биологические. Чашки Петри ГОСТ 30204-95 - Приборы холодильные бытовые. Эксплуатационные характеристики и методы испытаний. ГОСТ 33216-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами. ГОСТ 555-81 - Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия. ГОСТ 6709-72 - Вода дистиллированная. Технические условия. ГОСТ 92-84 – 75 Предметные стекла
Определения
В настоящей дипломной работе применены следующие термины с соответствующими определениями: Адипоцит – клетка, из которой в основном состоит жировая ткань. Ассиметричный митоз – образование двух разных клеток, одна из которых способна делиться, а другая – утрачивает способность к делению, или из нее образуются клетки. Гемопоэз – это процесс образования, развития и созревания клеток крови- лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов у позвоночных. Гемопоэтическая стволовая клетка – мультипотентная стволовая клетка взрослого организма, способная к дифференцировке во все клетки крови. Дифференцировка – возникновение различий между однородными клетками и тканями, изменения в ходе развития особи, приводящие к формированию специализированных клеток, органов и тканей. Кардиомиоциты – мышечные клетки сердца. Клеточная трансплантация – трансплантация (трансфузия) различных типов клеток с целью восстановления поврежденных тканей и органов, либо замещения патологически измененных собственных клеток реципиента. Мезенхима – 4-й зародышевый листок, образующийся из мезлдермы, дающий начало дерме, костям, хрящам и всей соединительной ткани организма. Мезенхимальные стволовые клетки – плюрипотентные стволовые клетки, содержащиеся главным образом в костном мозге, способные дифференцироваться в костную, мышечную, хрящевую, жировую ткани. Мультипотентность – способность клетки дифференцироваться в разные типы зрелых клеток одного вида ткани. Недифференцированная клетка – клетка, не обладающая характеристиками клеток той или иной тканевой принадлежности и способная претерпевать процесс дифференцировки. Остеобласты – молодые остеобразующие клетки кости, которые синтезируют межклеточное вещество – матрикс. Пластичность – гипотетическая способность стволовых клеток взрослого организма дифференцироваться в клетки нескольких направлений дифференцировки – производных различных зародышевых листков под воздействием различных стимулов. Плюрипотентность – способность клетки дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка). Прогениторные клетки – стволовые клетки, детерминированные на дифференцировку в определенный тип клеток. Пролиферация – процесс клеточного деления, осуществляющегося путем митоза. Регенеративная медицина – область медицины, занимающаяся вопросами восстановления поврежденных или патологически измененных тканей и органов посредством трансплантации стволовых клеток, клеток – предшественников и управления их дифференцировкой. Самообновление стволовых келток – способность стволовых клеток поддерживать себя в недиффференцированном состоянии. За счет микроокружения и влияния специфических ростовых факторов. Симметричный митоз – наиболее распространенная в природе форма митоза, в результате которой получаются две одинаковые клетки. Стволовость – способность к самообновлению и дифференцировке. Стволовые клетки – недифференцированные (незрелые) клетки, способные самообновляться, посредством митоза и дифференцироваться в специализированные клетки, то есть превращаться в клетки различных органов и тканей. Стромальные клетки – совокупность клеток преимущественно соединительнотканной природы (ММСК, ретикулярных клеток, адипоцитов, фибробластов) формирующих каркас кроветворных органов. Тотипотентность – способность клетки путем деления дать начало любому клеточному типу организма. Тканевая инженерия – междисциплинарная область знаний, включающая в себя биологию, медицину и технические науки, изучающая создание in vitro эквивалентов тканей и органов, использующая принцип трасплантации клеточной культуры на биосовместимом носителе. Трансплантант - совокупность клеток, фрагмент ткани или орган, используемый для пересадки. Фибробласты – клетки, соединительной ткани организма, синтезирующие внеклеточный матрикс. Хондроциты – основные специализированные клетки хрящевой ткани, которые производят все компоненты хрящевого матрикса одновременно. Эмбриональные стволовые клетки – тип плюрипотентных клеток, поддерживаемых в культуре, которые получают из внутренней клеточной массы бластоцисты на ранней стадии развития эмбриона
Обозначения и сокращения
В настоящей дипломной работе применены следующие обозначения и сокращения: ед/мл - единица в одном миллилитре ЖТ – жировая ткань кл/мл – количество клеток в миллилитре К-П – клетки-предшественники мА - миллиампер мкг/мл - микрограмм на миллилитр мкл - микролитр мл - миллилитр млн - миллион мм - миллиметр МСК – мезенхимальные стволовые клетки нг/мл - нанограмм на миллилитр ПК – прогениторная клетка об./мин – количество оборотов в минуту см – сантиметр СК – стволовые клетки ФГА – фитогемагтлютинин ФСР – фосфатно-солевой буфер ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭСК – эмбриональные стволовые клетки ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка FBS - фетальная бычья сыворотка °С – Градус
Введение
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) – это недифференцированные клетки, происходящие из мезодермального зародышевого листка, обладающие способностью к самоподдержанию популяции и дифференцировке в клетки мезенхимального ряда [1]. Впервые МСК были описаны как клетки костного мозга с фибробластоподобной морфологией, способные прикрепляться к поверхности культурального пластика и формировать колонии in vitro, а также дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях. Термин «стволовая клетка» (нем. Stammzelle) был предложен к широкому использованию русским гистологом А. А Максимовым в 1908. Он описал гемопоэтические стволовые клетки и доказал их существование методами своего времени, именно для них был введён термин. А. А Максимов во многом предопределил направление развития мировой науки в области клеточной биологии. Несколько позже, в 1970 году профессор московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи, А. Я. Фриденштейн изучал возможности этих особых клеток и подтвердил предположение коллеги. Оказалось, что клетки костного мозга, эксплантированные в культуру, жизнеспособны и могут длительно пролиферировать. Они обладали высокой эффективностью клонирования и способностью дифференцироваться в другие типы клеток мезодермы. Клетки, первоначально названные как образующие колонии фибробласты (CFU-F), позже получили название мезенхимных стромальных (стволовых) клеток (МСК). В более поздних работах также была продемонстрирована способность МСК дифференцироваться в клетки эндотелия, кардиомиоциты, нейроны и астроциты [1]. В целостном организме МСК выполняют гомеостатические функции и служат для восполнения утраченных элементов кровеносных сосудов и опорно-двигательного аппарата, для заживления ран, для построения сосудистой сети плода и плаценты. Осуществление перечисленных функций МСК обеспечивается экспрессией генов, кодирующих широкий спектр адгезионных молекул, цитокинов, хемокинов и их рецепторов [2]. С этими свойствами, а также с возможностью культивирования МСК in vitro, связано их интенсивное изучение и применение в качестве основы для клеточной терапии различных заболеваний [3]. Актуальность. Мезенхимальные стволовые клетки служат прекрасной моделью для исследования важнейших проблем клеточной биологии и биологии развития – таких как механизмы гистогенеза и регенерации тканей, пути регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки [1]. В настоящее время в исследовании МСК достигнут значительный прогресс: охарактеризованы профиль экспрессии генов и спектр продуцируемых цитокинов, исследовано влияние условий культивирования на пролиферацию и дифференцировку un vitro, выявлены сигнальные пути, контролирующие основные направления дифференцировки, частично раскрыты механизмы направленной миграции в поврежденные ткани и участия в их регенерации [5]. Клетки с характеристиками МСК обнаружены в большинстве тканей и органов как развивающегося, так и зрелого организма. По-видимому, они локализуются в соединительной ткани, сопровождающей кровеносные сосуды и, согласно мнению ряда авторов, представляют собой специализированные перициты или адвентициальные клетки. МСК различной органной локализации в целом сходны между собой по морфологии, иммунофенотипическим характеристикам и широте потенциала к дифференцировке[2]. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы в пределах одного исследования, с помощью стандартизованных методических приемов сравнить функциональные характеристики МСК, выделенных из костного мозга и жировой ткани мышей и изучение их биологических характеристик. В соответствии с указанной целью в работе были поставлены следующие задачи: 1) Получить первичные культуры МСК из костного мозга и жировой ткани и сравнить свойства МСК, культивируемых в нормоксии и в гипоксии. 2) Сравнить ростовые характеристики и способность МСК к дифференцировке. 3) Сопоставить иммунофенотипические характеристики МСК, выделенных из указанных источников.
Обзор литературы Объекты исследований
Исследования проводились в лаборатории клеточной биотехнологии Национального центра биотехнологии, г.Астана. В качестве объекта для исследований использовали мезенхимальные стволовые клетки (МСК) выделенные из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) мышей. В опыте были использованы следующие животные: - мыши в возрасте 2-3 месяца, массой 16-25 грамм, для выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК). В качестве ростовой среды и среды для поддержания культивирования клеток использовали среду DMEM. Для выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) работу проводили с добавлением следующих компонентов: - нитрат серебра - раствор Версена - FBS (фетальная бычья сыворотка) - раствор тиосульфат натрия - раствор толуиновый синий - раствор масляной красный - раствор параформальдегид - 70 % этиловый спирт - раствор трипсина - ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка) Культивирование клеток происходит в стерильном ламинарном боксе 2 класса защиты. Необходимое оборудование и расходные материалы: - СО2-инкубатор при 5 % СО2 и температуре 370С - световой микроскоп - автоматический клеточный счетчик - флуоресцентный микроскоп Zeiss Axiovert 200M - флуоресцентный микроскоп Olympus BX61 - спектрофотометр - конические пробирки на 5 и 10 мл - культуральные флаконы на 5, 15 и 25 мл - пипетки переменного объема на 20, 200 и 1000 мкл и стерильные наконечники - чашки Петри - пипетки Пастера - покровные стекла - 96-ти луночные планшеты - матрасы на 25 и 75 мл - вортекс - камера Горяева - цитофлуориметр - микроножницы - препаровальный столик - ампулы на 2 мл
Методы исследований Приготовление питательной среды DMEM Питательная среда DMEM выпускается в жидком виде, представляет собой стерильную прозрачную жидкость, окрашенную феноловым красным в красный цвет, имеющую рН 7, 2-7, 3. Содержащую необходимые аминокислоты, витамины и соли. Является основой для бессывороточных сред. При использовании этой среды необходим инкубатор с 10% концентрацией СО2. Приготовление питательной среды DMEM. Процесс приготовления питательной среды заключается в дополнении к основной среде DMEM 45 мл, 10% фетальной бычьей сыворотки FBS 5мл, антибиотик 500 мкл и раствора глютамакса в количествах соответствующих изобретению, в данном случае 500 мкл. Растворение компонентов питательной среды проводится в стерильных условиях, в ламинаре, при комнатной температуре. Порядок и приоритет добавления компонентов в питательную среду не существенен. Выделение МСК из костного мозга мышей Самца забивают методом цервиальной дислокации. Извлекают бедренные и большие берцовые кости, освобождают от мягких тканей. Эпифизы полученных костей отделяют. Диафизы бедренных и больших берцовых костей промывают средой DMEM, содержащей 15% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (КРС), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 12 мМ глютамина (ростовая среда). Выделенные из диафизов костей клетки помещают в конические пробирки, содержащие 5 мл ростовой среды, и центрифугируют 10 мин при 400g. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок из каждой пробирки ресуспендируют в ростовой среде до концентрации 1× 10 6 кл/мл. полученные клетки высаживают на 25 см2 культуральные флаконы по 5мл суспензии в флакон. Культивирование проводят в СО2-инкубаторе при 5% СО2 и температуре 370с. Через 48 часов прикрепившиеся клетки удаляют, а во флаконы добавляют по 7 мл свежей ростовой среды. Прикрепившиеся клетки культивируют в течение 2 недель, меняя ростовую среду каждые 3-4 дня. При достижении монослоя клетки промывают 2 раза 0, 25% раствором трипсина в смеси с раствором Версена в соотношении 1: 1. Затем во флакон добавляют 2 мл вышеуказанной смеси и инкубатор при 370с 5-10 мин. Клетки переводят в суспензию встряхиванием. Полученную суспензию клеток осаждают центрифугированием при 400 g в течение 5 мин. Полученные клетки (рисунок 1) высаживают на 25 см2 культуральные флаконы по 5 мл суспензии на флакон. Культивирование проводят до достижения клетками конфлуэнтности. После 4 пассажа к ростовой среде добавляют фактор роста фибробластов до концентрации 10 нг/мл [38].
Рисунок 1. Пассаж МСК выделенных из костного мозга мышей на 25 см2 культуральные флаконы Выделение МСК из жировой ткани мышей Самца умерщвляли методом дислокации шейных позвонков. Затем животное фиксировали к препаровальному столику в положении на спине, дифференцировали брюхо 70 % спиртом. Стерильными ножницами вскрывали брюшную полость, из пахового участка выделяли ЖТ. Фрагменты ЖТ промывали несколько раз в свежих пропорциях раствора PBS. Для получения МСК из ЖТ в условиях культивирования фрагменты ЖТ в стерильных условиях измельчали микроножницами (рисунок 2), инкубировали в 0, 075 % растворе коллагеназы в течение 60 мин при температуре 37°С, при постоянном помешивании. Фермент инактивировали путем добавления среды DMEM (Sigma) и 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), клетки осаждали путем центрифугирования в течение 5-10 мин при скорости 1000 об./мин. Жидкую фазу со зрелыми жировыми клетками удаляли пипеткой Пастера, осадок ресуспендировали в среде роста (DMEM + 10% ЭТС). Выделяли мононуклеарные клетки путем центрифугирования в течение 30 мин при скорости 1000 об./мин в градиенте плотности Histopaque (Sigma). Полученную суспензию клеток отмывали дважды в среде роста путем центрифугирования в течение 10 мин при скорости 1000 об./мин, фильтровали через нейлоновый мешочек и после осаждения ресуспендировали в среде роста. Затем клетки помещали на дно пластиковых Петри 5-9*10б клеток на 1 чашку. Распределяли суспензию равномерно по всей поверхности дна чашки Петри. Культуры содержали в СО2-инкубаторе в стандартных условиях (95% влажности, 37 °С). Для удаления неадгезированных элементов на следующие сутки питательную среду в культурах заменяли, добавляли факторы роста – 20 нг/мл bFGF (Sigma) и 20 нг/мл EFG (Sigma). В последующем культуральную среду меняли каждые 3-4 суток [32] [39].
Рисунок 2. Измельчение ЖТ микроножницами Пассирование клеток Пассирование клеток осуществляли по стандартной методике в культуральных флаконах в СО2-инкубаторе (рисунок 3) ( 370 с, 5 % СО2, 80% влажности). Смену среды осуществляли 2 раза в неделю. При достижении монослоем 80%-ой конфлюэнтности, клетки переводили в суспензию с использованием раствора 0, 25% трипсина с Версеном (1: 1) и рассевали в соотношении 1: 3. Долговременная криоконсервация клеток осуществлялась в сосудах Дьюара с жидким азотом. Для замораживания использовали криопробирки и замораживатель.
Рисунок 3. Пассирование клеток в СО2-инкубаторе
Снятие клеток с культуральных сосудов 1. Слить старую среду 2. 2-3 раза промыть клетки трипсином ЭДТА 3. Залить раствором для снятия клеток 4. Инкубировать при 370с, периодически аккуратно покачивая, обычно клетки отделяются от субстрата через 5-10 минут (время зависит от клеточной линии) 5. Когда клетки полностью отделяются от субстрата, добавить полной среды (рисунок 4) или PBS и тщательно диспергировать клетки 6. Если необходимо отмыть клетки от раствора для снятия клеток, осадить центрифугированием и ресуспендировать 7. Считать и субкультивировать
Рисунок 4. Добавление полной среды DMEM Определение количества клеток Количество клеток можно посчитать в камере Горяева (рисунок 5). Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые проницаемы и не окрашиваются. Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии смешивают с равным количеством раствора красителя HBSS. Несколько микролитров смеси вносится под покровное стекло камеры Горяева. Количество «квадратов», в которых просчитываются клетки зависит от плотности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40-50 клеток) [39].
Рисунок 5. Определение количества клеток методом исключения красителя в камере Горяева Размораживание клеток Замороженные клетки достаточно хрупкие (плохо переносят пипетирования) и требуют аккуратного обращения. Клетки размораживают быстро и помещают сразу в полную ростовую среду. Если клетки чувствительны к криоконсервантам (глицерин), их центрифугируют, чтобы удалить криоконсервант, и затем сажают в полную ростовую среду [39]. Замораживание клеток 1. Только для прикрепленных культур: максимально аккуратно снять клетки с субстрата, ресуспендировать клетки в полной среде 2. Просчитать количество живых клеток 3. Осадить клетки (центрифугированием), удалить супернатант, не затрагивая клеточный осадок 4. Ресуспендировать клетки в концентрации 1× 107 - 5× 107 клеток мл в среде для замораживания с сывороткой 5. Разлить в ампулы (2 мл пробирки с завинчивающимися крышками) для замораживания, охладить ампулы в ледяной бане (5 мин) или в холодильнике на +40с 6. Клетки замораживать медленно 7. После замерзания ампулы переносят для хранения в жидкий азот (рисунок 6)
Рисунок 6. Перенос клеток для хранения в жидкий азот Остеогенная, хондрогенная и адипогенная дифференцировка МСК Дифференцировка проводилась в экспоненциальной фазе роста клеточной культуры с конфлюэнтностью 60-80%, прошедшей визуальный контроль качества. Клетки снимали с подложки по стандартной процедуре с помощью трипсина/ Версена (1: 1) и определяли концентрацию клеточной суспензии с помощью камеры Горяева по стандартной методике. Клетки рассевали в 24-х луночные культуральные планшеты с покровными стеклами на дне лунок из начальной концентрации 105 кл/лунку и культивировали на протяжении 3 недель с заменой среды каждые 3 суток по стандартной методике в дифференцировочной среде: DMEM, 0, 1 мкМ дексаметазона, 0, 05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ глицерофосфата кальция для остеогенной дифференцировки, DMEM, 0, 1 мкМ дексаметазона, 0, 05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нг/ мл TGF –β хондрогенной дифференцировки и DMEM, 10%FBS, 1 мкМ дексаметазона, 0, 5 мкМ IBMX, 100 мкМ индометацина, 10 мкг/ мл инсулина в случае адипогенной дифференцировки [39]. В случае хондрогенной дифференцировки МСК в микромассе, клеточную культуру в экспоненциальной фазе роста с конфлюэнтностью 60-80% снимали с подложки по стандартной процедуре с помощью трипсина/ Версена (1: 1), после чего 5 млн. клеток с помощью мягкого центрифугирования (300g) осаждали на дно 15 мл пробирки с коническим дном и культивировали далее в таком виде в среде DMEM без сыворотки, содержащей 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 нг/мл TGF –β ыв течение 3 недель. Через 21 сутки культивирования из полученных микромасс готовили срезы на криотоме для окрашивания коллагена толуидиновым синим с целью подтверждения хондрогенной дифференцировки. Клеточные культуры фотографировали на инвертированном микроскопе с установленной на нем цифровой камерой.
Окраска исключающим витальным красителем трипановым синим (Trypan Blue) применялась для определения жизнеспособности клеточной культуры: мертвые клетки окрашиваются в синий цвет и хорошо различимы в светово1 микроскоп. Определение дегидрогеназной активности с помощью колориметрического МТТ-теста применялась для определения жизнеспособности клеточных культур. Клетки пересевали на 96-ти луночный планшет. Через 6 часов, когда клетки полностью адсорбировались на пластике, из лунок удаляли среду и вносили в каждую лунку по 100 мкл культуральной среды без фетальной телячьей сыворотки и по 10 мкл раствора бромид 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5- тетразолия (МТТ) 10 мг/мл в PBS. После инкубации 1 ч при 37 0с в атмосфере 7, 5 % СО2. после инкубации из лунок культурального планшета осторожно удаляли среду (следя за тем, чтобы не захватить клетки) и вносили по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для экстракции внутриклеточного МТТ-формазана. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при длине волны 540 нм против 100 мкл ДМСО. Индикация фосфата кальция методом окрашивания по Ван Косу использовалась для подтверждения остеогенной дифференцировки МСК. Клеточную культуру, выращенную на покровных стеклах, трехкратно промывали PBS и фиксировали метанолом в течение 2 мин при комнатной температуре. Затем фиксировали клетки двукратно отмывали PBS и окрашивали 1-2 % раствором нитрата серебра в течение 40-50 мин под ультрафиолетовым светом. Затем клетки промывали дистиллированной водой и фиксировали окраску 2, 5-3 % тиосульфатом натрия в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого клетки снова промывали дистиллированной водой. Отложения фосфата кальция окрашиваются в черный цвет. Индикация коллагена методом окрашивания толуидным синим позволяла подтвердить хондрогенную дифференцировку МСК по экспрессии коллагена – фибриллярного белка, составляющего основу хрящевой ткани. На криотоме готовили срезы клеточной культуры, выращенной методом микромасс. Полученные срезы окрашивали 1 % раствором толуидинового синего в 50 % изопропаноле. Коллаген окрашивается в синий цвет. Индикация липидов методом окраки масляным красным импользовалась для подтверждения алипогенной дифференцировки МСК, в результате которой последние накапливают жировые вакуоли. Культуру МСК, выращенную на покровных стеклах, троекратно промывали PBS и фиксировали метанолом в течение 2 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки еще дважды отмывали PBS. Окрашивание 0, 3 % раствором масляного красногов 60 % изопропаноле проводили в течение 10 мин. Жировые вакуоли окрашиваются в красный цвет. Анализ хромосомного состава клеток проводили путем цифровой обработки фотоизображенй. Клеточные культуры фотографировали на инвертированном микроскопе с установленной на нем цифровой камерой при помощи программного пакета. Фотосъемку полученных цитогенетических микропрепаратов проводили на флоуресцентном микроскопе с установленной на нем цифровой камерой при помощи программного пакета. Иммуноцитохимическая детекция поверхностных и внутриклеточных маркеров проводилась в культуре МСК, выращенной на покровных стеклах, которые троекратно промывали PBS и фиксировали клетки 4 %-ным растворм параформальдегида в течение 15 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки отмывали PBS и пермеабилизировали с помощью PBS, содержащего 1 % Triton X100, в течение10 мин при комнатной температуре, после чего отмывали PBS. Неспецифическое связывание мноклонадьных антител (МАТ) с подложкой блокировали в тесение30 мин при комнатной температуре в PBS содержанием 0, 5 % БСА 2% нормальную сыворотку крови козы, 0, 05 % Tween-20, 0, 01 мертиолат. Разведение МАТ против поверхностных клеточных маркеров (первичных антител) – виментина, нестина и вторичных (антивидовых) МАТ готовили на этом же буфере. Затем клетки инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение 90 мин, отмывали PBS с добавлением 0, 5 % БСА и 0, 05 % Tween-20. Инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной тепературе в течение 60 мин и также отмывали PBS с добавлением 0, 5 % БСА и 0, 05 % Tween-20. ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS. Полученные препараты заключали в среду для протектирования флоуресценции. В качестве вторичных антител применялись антивидовые антитела, меченные флоуресцентными красителями – роданином и флоуресцеин-5- изотиоцианатом. Иммуноцитохимическая детекция маркеров клеточной дифференцировки проводилась для подтверждения остеогенной (остеонектина) и хондрогенной (хондроитина и коллагена 1 и 2 типов) дифференцировки МСК. После дифференцировки МСК, покровные стекла с растущими на них клетками промывали PBS (рН 7, 4) с 0, 02 Tween-20 и фиксировали охлажденным 70 % этанолом в течение 20 мин при температуре + 4 0с. Фиксированные клетки троекратно промывали PBS (рН 7, 4) и помещали на 30 мин в 2 % раствор FBS в PBS (рН 7, 4) (для блокировки неспецифической сорбции антител). МАТ против остеонектина, хондроитина и коллагена 1 и 2 типов (первичные антитела) добавляли в рабочей концентрации согласно рекомендациям производителя в PBS (рН 7, 4) с 2 %-ой FBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Покровные стекла с клетками троекратно промывали PBS (рН 7, 4) с 0, 02 % Tween-20. инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 60 мин и также отмывали PBS с 0, 5 % БСА и 0, 05 % Tween-20. ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS. Полученные препараты заключали в среду для защиты от выгорания флоуресценции. В качестве вторичных антител применяли антивидовые антитела, меченные флоуресцентными красителями – роданином и FITC. Проточная цитофлуориметрия применялась для исследования экспрессии клетками поверхностных белков. Монослойную клеточную культуру переводили в суспензию с помощью Версена. Окрашивание клеток проводили МАТ, меченными FITC, в PBS, содержащем 1 % FBS, с последующей фиксацией 2 % раствором параформальдегида. Анализ проводили с помощью проточного цитофлуориметра. Морфологическая характеристика МСК Морфологическую характеристику МСК проводили с помощью программы CapturePro v2.8.8. при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового инвертированного микроскопа. Определение среднего размера клеток проводили для МСК, сняты х с подложки во время пассирования культуры, с помощью автоматического клеточного счетчика [39]. Иммунофенотипирование культур МСК Поверхностные маркеры мезенхимальных стволовых клеток выявляли с помощью меченных флуорохромами антител против CD34, CD35, CD90, CD105, CD73, CD13, CD10, CD44, CD14, CD117 на проточном цитофлуориметре в соответствии с инструкцией производителя. Для этого культуры МСК снимали последовательно 0, 02% раствором Версена и 0, 25% раствором трипсина. Действием раствором трипсина останавливали внесением ФСР с 10 % заменителя сыворотки. Полученную суспензию дважды отмываои ФСР и суспендировали в 200 мкл ФСР для последующего анализа на проточном цитофлуориметре. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения СХР [38].
Результаты исследований Иммунофенотип МСК
Одной из основных характеристик МСК является иммунофенотип. Нами было проведено сравнение иммунофенотипа первичных культур МСК, полученных из образцов костного мозга и жировой ткани. Анализ проводили на 2 и 3 пассаже, определяя следующие поверхностные антигены: CD90+, CD105+, CD44+, CD10+, CD13+, CD73+, CD45+, CD34+, CD117, CD14. Все культуры на момент анализа находились в логарифмической фазе роста, конфлюентность была в пределах 50-75%. Процентное содержание клеток, положительных по экспрессии поверхностных антигенов CD90, CD105, CD44, CD73, и отрицательных по экспрессии СD45, CD34, CD117, CD14, в культурах МСК, полученных из разных источников, было схожим и превышало 90%, что указывает на однородность всех проанализированных культур по экспрессии этих антигенов. Наибольшая вариабельность наблюдалась по экспрессии CD13 (аминопептидаза N) СD10 (нейтральная эндопептидаза) в культурах МСК костного мозга на втором пассаже. При дальнейшем культивировании (начиная с 3 пассажа) CD10 и CD13 экспрессировали 83±10% и 71±12, 5 клеток (таблица 2).
Таблица 2 - Доля клеток экспрессирующих указанные поверхностные антигены в культурах МСК (2 пассаж), полученных из разных источников.
Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом сходный иммунофенотип. Исключением является показатель средней интенсивности флоуресценции клеток, экспрессирующих CD90. Оценка средней интенсивности флоуресценции показала достоверные отличия в уровне экспрессии CD90 между МСК костного мозга, по сравнению с МСК жировой ткани. МСК, выделенные из разных источников, могут отличаться по уровню экспрессии CD105. Средняя интенсивность флоуресценции МСК жировой ткани, является достаточно постоянной в различных культурах (рисунок 11). Индивидуальная вариабельность культур МСК костного мозга и жировой ткани, затрудняет определение влияния тканевого происхождения клеток на экспрессию CD105.
Рисунок 11. Средняя интенсивность флоуресценции МСК из разных источников, экспрессирующих антиген CD105. Указаны стандартные отклонения. Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом сходный иммунофенотип, но существует различия в экспрессии CD10, CD13, CD105 и CD90.
Заключение В соответствии с поставленной целью было проведено изучение ростовых и иммунофенотипических характеристик МСК, выделенных из костного мозга и жировой ткани мышей, а также были проанализированы проявления их функциональной активности. 1. Из жировой ткани можно получить МСК в большем количестве и с более высоким пролиферативным потенциалом, чем из аспирата костного мозга. 2. Культуры МСК из костного мозга и жировой ткани сходны по морфологическим признакам, обладают одинаковым содержанием клеток, несущих МСК-ассоциированные маркеры, за исключением CD10 и CD13, но отличаются по уровню экспрессии CD90. 3. Модулирующее действие МСК на Т-лимфоциты является общим свойством МСК, выделенных из разных источников, которое проявляется в дозозависимом подавлении пролиферации Т-лимфоцитов, стимуляции экспрессии раннего маркера активации, а также блокирования индуцированного увеличения экспрессии позднего маркера активации Т-лимфоцитов
Самуратова Д. М.
Популярное:
|
Последнее изменение этой страницы: 2016-07-13; Просмотров: 945; Нарушение авторского права страницы
