Использование мезенхимальных стволовых клеток в медицине

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 4Следующая ⇒

В клинике использование производных мезенхимальных стволовых клеток связано, прежде всего, с восстановлением тканевых дефектов, возникающих при обширных и глубоких термических поражениях кожи. На доклиническом этапе была проведена экспериментальная оценка целесообразности применения аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток для лечения глубоких ожогов.

Во время сравнительного исследования скорости заживления ран при использовании фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов, а также без применения клеточной терапии отмечено ускорение темпа заживления ожоговой поверхности в результате трансплантации фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток и эмбриональных фибробластов [31]. Однако в случае использования аллогенных фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток скорость заживления ран была выше, чем при трансплантации эмбриональных фибробластов. Это выражалось в ускорении смены фаз регенераторного процесса - сокращались сроки клеточной инфильтрации, повышался темп разрастания сосудистой сети, а также образования грануляционной ткани [32].

Общепризнано, что первоочередной задачей лечения ожоговой болезни является максимально полное и быстрое восстановление поврежденного кожного покрова для предупреждения возникающих при этом токсических влияний, инфекционных осложнений и обезвоживания организма. Результаты применения культивированных клеток в значительной степени зависят от подготовленности к трансплантации самой ожоговой раны. В случаях трансплантации культивированных кератиноцитов на раневую поверхность после хирургической некрэктомии приживляется в среднем 55% (по площади) пересаженных клеток, тогда как при гранулирующих ранах частота приживления снижается до 15%. Поэтому успешное лечение обширных глубоких ожогов кожи требует, в первую очередь, активной хирургической тактики [33].

Первые сообщения об успешном использовании культивированных кератиноцитов с целью покрытия ожоговой поверхности появились в начале восьмидесятых годов прошлого века. Другие биотехнологические методы, такие как коллагенопластика, трансплантация криоконсервированной ксенокожи, а также использование различных биополимерных покрытий повышают эффективность лечения обширных поверхностных, но не глубоких ожогов. Метод покрытия раневой поверхности с помощью культивированных фибробластов принципиально отличается тем, что в качестве основного компонента культивированного пласта клеток используются не кератиноциты, а фибробласты [34].

Предпосылкой для разработки метода послужили данные о том, что перициты, окружающие мелкие сосуды, являются про- гениторными мезенхимальными клетками, способными трансформироваться в фибробласты, которые продуцируют многие факторы роста и обеспечивают заживление раны за счет сильного стимулирующего воздействия на пролиферацию и адгезию кератиноцитов. Использование культивированных фибробластов для закрытия раневых поверхностей сразу же выявило ряд существенных преимуществ этого метода по сравнению с применением культивированных кератиноцитов [35].

В настоящее время экспериментально отработана методика культивирования аутологичных фибробластов человека, устраняющая указанные выше недостатки и не приводящая к онкогенной трансформации нормальных фибробластов. Полученные по такой методике аутологичные фибробласты используются для восполнения дефектов мягких тканей лица [36].

Предпринимаются попытки использования аутологичных костномозговых мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников для лечения дегенеративных поражений суставов. Проводятся первые клинические испытания применения культивируемых мезенхимальных прогениторных клеток в терапии сложных переломов кости. Ауто- и аллогенные мезенхимальные клетки стромы костного мозга используются для создания хрящевой ткани с целью трансплантации при коррекции дефектов суставного хряща вследствие травмы или аутоиммунных поражений. Отрабатываются методики клинического применения мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников для устранения костных дефектов у детей с тяжелой формой незавершенного остеогенеза, вызванной мутациями гена коллагена I типа [35].

Продолжается совершенствование методик генетической модификации донорских мезенхимальных стволовых клеток с целью коррекции генетических дефектов стромальных тканей. Предполагается, что уже в ближайшее время мезенхимальные клетки-предшественники будут использоваться в неврологии для направленной химеризации клеток мозга и создания здорового пула клеток, способного генерировать дефицитный фермент или фактор, ответственный за клинические проявления заболевания. Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток может использоваться для восстановления стромы костного мозга у онкологических больных после радио- и химиотерапии, а в сочетании с костномозговыми клетками - для восстановления гемопоэза. Развитию заместительной терапии, направленной на устранение дефектов опорно-двигательного аппарата с помощью МСК, способствуют инженерные разработки в области конструирования матричных биоматериалов или биомиметиков, формирующих каркасы, заселяемые потомством мезенхимальных стволовых клеток [36].

1.7 Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток

В клинической трансплантологии мезенхимальные стволовые клетки человека могут быть использованы для обеспечения экспансии гемопоэтических стволовых клеток, а также их ранних прекоммитированных потомков. В частности, введение аутологичных гемопоэтических стволовых клеток и МСК онкологическим больным после проведения высокодозовой химиотерапии ускоряет восстановление количества нейтрофилов и тромбоцитов в периферической крови. Алло- и аутогенные пересадки мезенхимальных стволовых клеток применяются для лечения множественной миеломы, апластической анемии и спонтанной тромбоцитопении - заболеваний, связанных с первичным дефектом стромы кроветворной ткани. Эффективность клеточной терапии при онкогематологической патологии во многих случаях выше при одновременном введении стромальных и гемопоэтических стволовых клеток, что проявляется сокращением послеоперационного периода восстановления кроветворения, снижением числа летальных исходов вследствие неселективного разрушения регионарных и циркулирующих раковых клеток, при котором погибают и собственные прогениторные кроветворные клетки больного. Перспективность применения МСК и других мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников в клинической практике обусловлена относительной легкостью получения их из аспиратов костного мозга, экспансии в культуре и трансфекции терапевтических генов. При этом для восполнения местных тканевых дефектов можно использовать локальную имплантацию мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников, а при системных дисфункциях тканей мезенхимального происхождения не исключается их введение в общий кровоток [37].

Материалы и методы исследований

Объекты исследований

Исследования проводились в лаборатории клеточной биотехнологии Национального центра биотехнологии, г.Астана.

В качестве объекта для исследований использовали мезенхимальные стволовые клетки (МСК) выделенные из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) мышей.

В опыте были использованы следующие животные:

- мыши в возрасте 2-3 месяца, массой 16-25 грамм, для выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК).

В качестве ростовой среды и среды для поддержания культивирования клеток использовали среду DMEM.

Для выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) работу проводили с добавлением следующих компонентов:

- нитрат серебра

- раствор Версена

- FBS (фетальная бычья сыворотка)

- раствор тиосульфат натрия

- раствор толуиновый синий

- раствор масляной красный

- раствор параформальдегид

- 70 % этиловый спирт

- раствор трипсина

- ЭТС (эмбриональная телячья сыворотка)

Культивирование клеток происходит в стерильном ламинарном боксе 2 класса защиты.

Необходимое оборудование и расходные материалы:

- СО²-инкубатор при 5 % СО² и температуре 37⁰С

- световой микроскоп

- автоматический клеточный счетчик

- флуоресцентный микроскоп Zeiss Axiovert 200M

- флуоресцентный микроскоп Olympus BX61

- спектрофотометр

- конические пробирки на 5 и 10 мл

- культуральные флаконы на 5, 15 и 25 мл

- пипетки переменного объема на 20, 200 и 1000 мкл и стерильные наконечники

- чашки Петри

- пипетки Пастера

- покровные стекла

- 96-ти луночные планшеты

- матрасы на 25 и 75 мл

- вортекс

- камера Горяева

- цитофлуориметр

- микроножницы

- препаровальный столик

- ампулы на 2 мл

Методы исследований

Приготовление питательной среды DMEM

Питательная среда DMEM выпускается в жидком виде, представляет собой стерильную прозрачную жидкость, окрашенную феноловым красным в красный цвет, имеющую рН 7, 2-7, 3. Содержащую необходимые аминокислоты, витамины и соли. Является основой для бессывороточных сред. При использовании этой среды необходим инкубатор с 10% концентрацией СО². Приготовление питательной среды DMEM. Процесс приготовления питательной среды заключается в дополнении к основной среде DMEM 45 мл, 10% фетальной бычьей сыворотки FBS 5мл, антибиотик 500 мкл и раствора глютамакса в количествах соответствующих изобретению, в данном случае 500 мкл. Растворение компонентов питательной среды проводится в стерильных условиях, в ламинаре, при комнатной температуре. Порядок и приоритет добавления компонентов в питательную среду не существенен.

Выделение МСК из костного мозга мышей

Самца забивают методом цервиальной дислокации. Извлекают бедренные и большие берцовые кости, освобождают от мягких тканей. Эпифизы полученных костей отделяют. Диафизы бедренных и больших берцовых костей промывают средой DMEM, содержащей 15% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (КРС), 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 12 мМ глютамина (ростовая среда). Выделенные из диафизов костей клетки помещают в конические пробирки, содержащие 5 мл ростовой среды, и центрифугируют 10 мин при 400g. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок из каждой пробирки ресуспендируют в ростовой среде до концентрации 1× 10 6 кл/мл. полученные клетки высаживают на 25 см² культуральные флаконы по 5мл суспензии в флакон. Культивирование проводят в СО²-инкубаторе при 5% СО² и температуре 37⁰с. Через 48 часов прикрепившиеся клетки удаляют, а во флаконы добавляют по 7 мл свежей ростовой среды. Прикрепившиеся клетки культивируют в течение 2 недель, меняя ростовую среду каждые 3-4 дня. При достижении монослоя клетки промывают 2 раза 0, 25% раствором трипсина в смеси с раствором Версена в соотношении 1: 1. Затем во флакон добавляют 2 мл вышеуказанной смеси и инкубатор при 37⁰с 5-10 мин. Клетки переводят в суспензию встряхиванием. Полученную суспензию клеток осаждают центрифугированием при 400 g в течение 5 мин. Полученные клетки (рисунок 1) высаживают на 25 см² культуральные флаконы по 5 мл суспензии на флакон. Культивирование проводят до достижения клетками конфлуэнтности. После 4 пассажа к ростовой среде добавляют фактор роста фибробластов до концентрации 10 нг/мл [38].

Рисунок 1. Пассаж МСК выделенных из костного мозга мышей на 25 см² культуральные флаконы

Выделение МСК из жировой ткани мышей

Самца умерщвляли методом дислокации шейных позвонков. Затем животное фиксировали к препаровальному столику в положении на спине, дифференцировали брюхо 70 % спиртом. Стерильными ножницами вскрывали брюшную полость, из пахового участка выделяли ЖТ. Фрагменты ЖТ промывали несколько раз в свежих пропорциях раствора PBS.

Для получения МСК из ЖТ в условиях культивирования фрагменты ЖТ в стерильных условиях измельчали микроножницами (рисунок 2), инкубировали в 0, 075 % растворе коллагеназы в течение 60 мин при температуре 37°С, при постоянном помешивании. Фермент инактивировали путем добавления среды DMEM (Sigma) и 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), клетки осаждали путем центрифугирования в течение 5-10 мин при скорости 1000 об./мин. Жидкую фазу со зрелыми жировыми клетками удаляли пипеткой Пастера, осадок ресуспендировали в среде роста (DMEM + 10% ЭТС). Выделяли мононуклеарные клетки путем центрифугирования в течение 30 мин при скорости 1000 об./мин в градиенте плотности Histopaque (Sigma). Полученную суспензию клеток отмывали дважды в среде роста путем центрифугирования в течение 10 мин при скорости 1000 об./мин, фильтровали через нейлоновый мешочек и после осаждения ресуспендировали в среде роста. Затем клетки помещали на дно пластиковых Петри 5-9*10б клеток на 1 чашку. Распределяли суспензию равномерно по всей поверхности дна чашки Петри. Культуры содержали в СО2-инкубаторе в стандартных условиях (95% влажности, 37 °С). Для удаления неадгезированных элементов на следующие сутки питательную среду в культурах заменяли, добавляли факторы роста – 20 нг/мл bFGF (Sigma) и 20 нг/мл EFG (Sigma). В последующем культуральную среду меняли каждые 3-4 суток [32] [39].

Рисунок 2. Измельчение ЖТ микроножницами

Пассирование клеток

Пассирование клеток осуществляли по стандартной методике в культуральных флаконах в СО²-инкубаторе (рисунок 3) ( 37⁰с, 5 % СО₂, 80% влажности). Смену среды осуществляли 2 раза в неделю. При достижении монослоем 80%-ой конфлюэнтности, клетки переводили в суспензию с использованием раствора 0, 25% трипсина с Версеном (1: 1) и рассевали в соотношении 1: 3. Долговременная криоконсервация клеток осуществлялась в сосудах Дьюара с жидким азотом. Для замораживания использовали криопробирки и замораживатель.

Рисунок 3. Пассирование клеток в СО²-инкубаторе

Снятие клеток с культуральных сосудов

1. Слить старую среду

2. 2-3 раза промыть клетки трипсином ЭДТА

3. Залить раствором для снятия клеток

4. Инкубировать при 37⁰с, периодически аккуратно покачивая, обычно клетки отделяются от субстрата через 5-10 минут (время зависит от клеточной линии)

5. Когда клетки полностью отделяются от субстрата, добавить полной среды (рисунок 4) или PBS и тщательно диспергировать клетки

6. Если необходимо отмыть клетки от раствора для снятия клеток, осадить центрифугированием и ресуспендировать

7. Считать и субкультивировать

Рисунок 4. Добавление полной среды DMEM

Определение количества клеток

Количество клеток можно посчитать в камере Горяева (рисунок 5). Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые проницаемы и не окрашиваются.

Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии смешивают с равным количеством раствора красителя HBSS. Несколько микролитров смеси вносится под покровное стекло камеры Горяева. Количество «квадратов», в которых просчитываются клетки зависит от плотности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40-50 клеток) [39].

Рисунок 5. Определение количества клеток методом исключения красителя в камере Горяева

Размораживание клеток

Замороженные клетки достаточно хрупкие (плохо переносят пипетирования) и требуют аккуратного обращения. Клетки размораживают быстро и помещают сразу в полную ростовую среду. Если клетки чувствительны к криоконсервантам (глицерин), их центрифугируют, чтобы удалить криоконсервант, и затем сажают в полную ростовую среду [39].

Замораживание клеток

1. Только для прикрепленных культур: максимально аккуратно снять клетки с субстрата, ресуспендировать клетки в полной среде

2. Просчитать количество живых клеток

3. Осадить клетки (центрифугированием), удалить супернатант, не затрагивая клеточный осадок

4. Ресуспендировать клетки в концентрации 1× 10⁷- 5× 10⁷клеток мл в среде для замораживания с сывороткой

5. Разлить в ампулы (2 мл пробирки с завинчивающимися крышками) для замораживания, охладить ампулы в ледяной бане (5 мин) или в холодильнике на +4⁰с

6. Клетки замораживать медленно

7. После замерзания ампулы переносят для хранения в жидкий азот (рисунок 6)

Рисунок 6. Перенос клеток для хранения в жидкий азот

Остеогенная, хондрогенная и адипогенная дифференцировка МСК

Дифференцировка проводилась в экспоненциальной фазе роста клеточной культуры с конфлюэнтностью 60-80%, прошедшей визуальный контроль качества. Клетки снимали с подложки по стандартной процедуре с помощью трипсина/ Версена (1: 1) и определяли концентрацию клеточной суспензии с помощью камеры Горяева по стандартной методике. Клетки рассевали в 24-х луночные культуральные планшеты с покровными стеклами на дне лунок из начальной концентрации 10⁵кл/лунку и культивировали на протяжении 3 недель с заменой среды каждые 3 суток по стандартной методике в дифференцировочной среде: DMEM, 0, 1 мкМ дексаметазона, 0, 05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ глицерофосфата кальция для остеогенной дифференцировки, DMEM, 0, 1 мкМ дексаметазона, 0, 05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нг/ мл TGF –β хондрогенной дифференцировки и DMEM, 10%FBS, 1 мкМ дексаметазона, 0, 5 мкМ IBMX, 100 мкМ индометацина, 10 мкг/ мл инсулина в случае адипогенной дифференцировки [39].

В случае хондрогенной дифференцировки МСК в микромассе, клеточную культуру в экспоненциальной фазе роста с конфлюэнтностью 60-80% снимали с подложки по стандартной процедуре с помощью трипсина/ Версена (1: 1), после чего 5 млн. клеток с помощью мягкого центрифугирования (300g) осаждали на дно 15 мл пробирки с коническим дном и культивировали далее в таком виде в среде DMEM без сыворотки, содержащей 100 ед/мл пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 нг/мл TGF –β ыв течение 3 недель. Через 21 сутки культивирования из полученных микромасс готовили срезы на криотоме для окрашивания коллагена толуидиновым синим с целью подтверждения хондрогенной дифференцировки.

Клеточные культуры фотографировали на инвертированном микроскопе с установленной на нем цифровой камерой.

Окраска исключающим витальным красителем трипановым синим (Trypan Blue) применялась для определения жизнеспособности клеточной культуры: мертвые клетки окрашиваются в синий цвет и хорошо различимы в светово1 микроскоп.

Определение дегидрогеназной активности с помощью колориметрического МТТ-теста применялась для определения жизнеспособности клеточных культур. Клетки пересевали на 96-ти луночный планшет. Через 6 часов, когда клетки полностью адсорбировались на пластике, из лунок удаляли среду и вносили в каждую лунку по 100 мкл культуральной среды без фетальной телячьей сыворотки и по 10 мкл раствора бромид 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5- тетразолия (МТТ) 10 мг/мл в PBS.

После инкубации 1 ч при 37 ⁰с в атмосфере 7, 5 % СО₂. после инкубации из лунок культурального планшета осторожно удаляли среду (следя за тем, чтобы не захватить клетки) и вносили по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для экстракции внутриклеточного МТТ-формазана. Оптическую плотность измеряли спектрофотометрически при длине волны 540 нм против 100 мкл ДМСО.

Индикация фосфата кальция методом окрашивания по Ван Косу использовалась для подтверждения остеогенной дифференцировки МСК. Клеточную культуру, выращенную на покровных стеклах, трехкратно промывали PBS и фиксировали метанолом в течение 2 мин при комнатной температуре. Затем фиксировали клетки двукратно отмывали PBS и окрашивали 1-2 % раствором нитрата серебра в течение 40-50 мин под ультрафиолетовым светом. Затем клетки промывали дистиллированной водой и фиксировали окраску 2, 5-3 % тиосульфатом натрия в течение 5 мин при комнатной температуре. После этого клетки снова промывали дистиллированной водой. Отложения фосфата кальция окрашиваются в черный цвет.

Индикация коллагена методом окрашивания толуидным синим позволяла подтвердить хондрогенную дифференцировку МСК по экспрессии коллагена – фибриллярного белка, составляющего основу хрящевой ткани. На криотоме готовили срезы клеточной культуры, выращенной методом микромасс. Полученные срезы окрашивали 1 % раствором толуидинового синего в 50 % изопропаноле. Коллаген окрашивается в синий цвет.

Индикация липидов методом окраки масляным красным импользовалась для подтверждения алипогенной дифференцировки МСК, в результате которой последние накапливают жировые вакуоли. Культуру МСК, выращенную на покровных стеклах, троекратно промывали PBS и фиксировали метанолом в течение 2 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки еще дважды отмывали PBS. Окрашивание 0, 3 % раствором масляного красногов 60 % изопропаноле проводили в течение 10 мин. Жировые вакуоли окрашиваются в красный цвет.

Анализ хромосомного состава клеток проводили путем цифровой обработки фотоизображенй. Клеточные культуры фотографировали на инвертированном микроскопе с установленной на нем цифровой камерой при помощи программного пакета. Фотосъемку полученных цитогенетических микропрепаратов проводили на флоуресцентном микроскопе с установленной на нем цифровой камерой при помощи программного пакета.

Иммуноцитохимическая детекция поверхностных и внутриклеточных маркеров проводилась в культуре МСК, выращенной на покровных стеклах, которые троекратно промывали PBS и фиксировали клетки 4 %-ным растворм параформальдегида в течение 15 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки отмывали PBS и пермеабилизировали с помощью PBS, содержащего 1 % Triton X100, в течение10 мин при комнатной температуре, после чего отмывали PBS. Неспецифическое связывание мноклонадьных антител (МАТ) с подложкой блокировали в тесение30 мин при комнатной температуре в PBS содержанием 0, 5 % БСА 2% нормальную сыворотку крови козы, 0, 05 % Tween-20, 0, 01 мертиолат. Разведение МАТ против поверхностных клеточных маркеров (первичных антител) – виментина, нестина и вторичных (антивидовых) МАТ готовили на этом же буфере. Затем клетки инкубировали с первичными антителами при комнатной температуре в течение 90 мин, отмывали PBS с добавлением 0, 5 % БСА и 0, 05 % Tween-20. Инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной тепературе в течение 60 мин и также отмывали PBS с добавлением 0, 5 % БСА и 0, 05 % Tween-20. ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS. Полученные препараты заключали в среду для протектирования флоуресценции. В качестве вторичных антител применялись антивидовые антитела, меченные флоуресцентными красителями – роданином и флоуресцеин-5- изотиоцианатом.

Иммуноцитохимическая детекция маркеров клеточной дифференцировки проводилась для подтверждения остеогенной (остеонектина) и хондрогенной (хондроитина и коллагена 1 и 2 типов) дифференцировки МСК. После дифференцировки МСК, покровные стекла с растущими на них клетками промывали PBS (рН 7, 4) с 0, 02 Tween-20 и фиксировали охлажденным 70 % этанолом в течение 20 мин при температуре + 4 ⁰с. Фиксированные клетки троекратно промывали PBS (рН 7, 4) и помещали на 30 мин в 2 % раствор FBS в PBS (рН 7, 4) (для блокировки неспецифической сорбции антител). МАТ против остеонектина, хондроитина и коллагена 1 и 2 типов (первичные антитела) добавляли в рабочей концентрации согласно рекомендациям производителя в PBS (рН 7, 4) с 2 %-ой FBS и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Покровные стекла с клетками троекратно промывали PBS (рН 7, 4) с 0, 02 % Tween-20. инкубацию с вторичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 60 мин и также отмывали PBS с 0, 5 % БСА и 0, 05 % Tween-20. ядра клеток докрашивали раствором 1 мкг/мл DAPI в PBS. Полученные препараты заключали в среду для защиты от выгорания флоуресценции. В качестве вторичных антител применяли антивидовые антитела, меченные флоуресцентными красителями – роданином и FITC.

Проточная цитофлуориметрия применялась для исследования экспрессии клетками поверхностных белков. Монослойную клеточную культуру переводили в суспензию с помощью Версена. Окрашивание клеток проводили МАТ, меченными FITC, в PBS, содержащем 1 % FBS, с последующей фиксацией 2 % раствором параформальдегида. Анализ проводили с помощью проточного цитофлуориметра.

Морфологическая характеристика МСК

Морфологическую характеристику МСК проводили с помощью программы CapturePro v2.8.8. при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового инвертированного микроскопа. Определение среднего размера клеток проводили для МСК, сняты х с подложки во время пассирования культуры, с помощью автоматического клеточного счетчика [39].

Иммунофенотипирование культур МСК

Поверхностные маркеры мезенхимальных стволовых клеток выявляли с помощью меченных флуорохромами антител против CD34, CD35, CD90, CD105, CD73, CD13, CD10, CD44, CD14, CD117 на проточном цитофлуориметре в соответствии с инструкцией производителя. Для этого культуры МСК снимали последовательно 0, 02% раствором Версена и 0, 25% раствором трипсина. Действием раствором трипсина останавливали внесением ФСР с 10 % заменителя сыворотки. Полученную суспензию дважды отмываои ФСР и суспендировали в 200 мкл ФСР для последующего анализа на проточном цитофлуориметре. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения СХР [38].

Результаты исследований

⇐ Предыдущая 1 234 Следующая ⇒