Специальность 5В070100 – Биотехнология

Костанай, 2016

Министерство образования и науки Республики Казахстан Костанайский государственный университет имени А. Байтурсынова «Допущена к защите» Зав. кафедрой ТППЖ _________________Г. Шайкамал ___ _____________20___г. ДИПЛОМНАЯ РАБОТА на тему: «Получение и характеристика культур стволовых клеток» по специальности 5В070100-Биотехнология Выполнила: Самуратова Д. М., студентка 4 курса специальности 5В07010-Биотехнология Научный руководитель: Шевченко П. В., м.т.н., преподаватель Костанай, 2016 Содержание Введение……………………………………………………………………...... 7
1 Обзор литературы……………………………………………………………
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8	Стволовые клетки и их характеристика........................................... Дифференцировка стволовых клеток……………………………... Эмбриональные и соматические стволовые клетки……………… Источники мезенхимальных стволовых клеток………………….. Особенности мезенхимальных стволовых клеток……………….. Пересадка мезенхимальных стволовых клеток…………………... Использование мезенхимальных стволовых клеток в медицине.. Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток…………….
2 Материалы и методы исследования.............................................................
2.1 2.2	Объекты исследования……………………………………………... Методы исследования………………………………………………
3 Результаты исследования……………………………………………….......
3.1 3.2 3.3 3.4 3.5	Сравнение свойств МСК, культивируемых в нормоксии или в гипоксии……………………………………………………………... Ростовые характеристики и дифференцировка МСК……………. Иммунофенотип МСК……………………………………………… Проявление функциональной активности МСК при сокультивировании с лимфоидными клетками…………………... Охрана труда и окружающей среды……………………………….
Заключение ……………………………………………………………………. Список использованных источников…………………………………………

Нормативные ссылки

В настоящей дипломной работе использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 17299-78 - Спирт этиловый технический. Технические условия.

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия.

ГОСТ 19126-79Е - Инструменты медицинские металлические. Общие технические условия.

ГОСТ 20730-75 – Питательные среды.

ГОСТ 25336 – 82 Пробирки биологические. Чашки Петри

ГОСТ 30204-95 - Приборы холодильные бытовые. Эксплуатационные характеристики и методы испытаний.

ГОСТ 33216-2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами.

ГОСТ 555-81 - Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия.

ГОСТ 6709-72 - Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 92-84 – 75 Предметные стекла

Определения

В настоящей дипломной работе применены следующие термины с соответствующими определениями:

Адипоцит – клетка, из которой в основном состоит жировая ткань.

Ассиметричный митоз – образование двух разных клеток, одна из которых способна делиться, а другая – утрачивает способность к делению, или из нее образуются клетки.

Гемопоэз – это процесс образования, развития и созревания клеток крови- лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов у позвоночных.

Гемопоэтическая стволовая клетка – мультипотентная стволовая клетка взрослого организма, способная к дифференцировке во все клетки крови.

Дифференцировка – возникновение различий между однородными клетками и тканями, изменения в ходе развития особи, приводящие к формированию специализированных клеток, органов и тканей.

Кардиомиоциты – мышечные клетки сердца.

Клеточная трансплантация – трансплантация (трансфузия) различных типов клеток с целью восстановления поврежденных тканей и органов, либо замещения патологически измененных собственных клеток реципиента.

Мезенхима – 4-й зародышевый листок, образующийся из мезлдермы, дающий начало дерме, костям, хрящам и всей соединительной ткани организма.

Мезенхимальные стволовые клетки – плюрипотентные стволовые клетки, содержащиеся главным образом в костном мозге, способные дифференцироваться в костную, мышечную, хрящевую, жировую ткани.

Мультипотентность – способность клетки дифференцироваться в разные типы зрелых клеток одного вида ткани.

Недифференцированная клетка – клетка, не обладающая характеристиками клеток той или иной тканевой принадлежности и способная претерпевать процесс дифференцировки.

Остеобласты – молодые остеобразующие клетки кости, которые синтезируют межклеточное вещество – матрикс.

Пластичность – гипотетическая способность стволовых клеток взрослого организма дифференцироваться в клетки нескольких направлений дифференцировки – производных различных зародышевых листков под воздействием различных стимулов.

Плюрипотентность – способность клетки дифференцироваться во все типы клеток, кроме клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка).

Прогениторные клетки – стволовые клетки, детерминированные на дифференцировку в определенный тип клеток.

Пролиферация – процесс клеточного деления, осуществляющегося путем митоза.

Регенеративная медицина – область медицины, занимающаяся вопросами восстановления поврежденных или патологически измененных тканей и органов посредством трансплантации стволовых клеток, клеток – предшественников и управления их дифференцировкой.

Самообновление стволовых келток – способность стволовых клеток поддерживать себя в недиффференцированном состоянии. За счет микроокружения и влияния специфических ростовых факторов.

Симметричный митоз – наиболее распространенная в природе форма митоза, в результате которой получаются две одинаковые клетки.

Стволовость – способность к самообновлению и дифференцировке.

Стволовые клетки – недифференцированные (незрелые) клетки, способные самообновляться, посредством митоза и дифференцироваться в специализированные клетки, то есть превращаться в клетки различных органов и тканей.

Стромальные клетки – совокупность клеток преимущественно соединительнотканной природы (ММСК, ретикулярных клеток, адипоцитов, фибробластов) формирующих каркас кроветворных органов.

Тотипотентность – способность клетки путем деления дать начало любому клеточному типу организма.

Тканевая инженерия – междисциплинарная область знаний, включающая в себя биологию, медицину и технические науки, изучающая создание in vitro эквивалентов тканей и органов, использующая принцип трасплантации клеточной культуры на биосовместимом носителе.

Трансплантант - совокупность клеток, фрагмент ткани или орган, используемый для пересадки.

Фибробласты – клетки, соединительной ткани организма, синтезирующие внеклеточный матрикс.

Хондроциты – основные специализированные клетки хрящевой ткани, которые производят все компоненты хрящевого матрикса одновременно.

Эмбриональные стволовые клетки – тип плюрипотентных клеток, поддерживаемых в культуре, которые получают из внутренней клеточной массы бластоцисты на ранней стадии развития эмбриона

Обозначения и сокращения

В настоящей дипломной работе применены следующие обозначения и сокращения:

ед/мл - единица в одном миллилитре

ЖТ – жировая ткань

кл/мл – количество клеток в миллилитре

К-П – клетки-предшественники

мА - миллиампер

мкг/мл - микрограмм на миллилитр

мкл - микролитр

мл - миллилитр

млн - миллион

мм - миллиметр

МСК – мезенхимальные стволовые клетки

нг/мл - нанограмм на миллилитр

ПК – прогениторная клетка

об./мин – количество оборотов в минуту

см – сантиметр

СК – стволовые клетки

ФГА – фитогемагтлютинин

ФСР – фосфатно-солевой буфер

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭСК – эмбриональные стволовые клетки

ЭТС – эмбриональная телячья сыворотка

FBS - фетальная бычья сыворотка

°С – Градус

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) – это недифференцированные клетки, происходящие из мезодермального зародышевого листка, обладающие способностью к самоподдержанию популяции и дифференцировке в клетки мезенхимального ряда [1].

Впервые МСК были описаны как клетки костного мозга с фибробластоподобной морфологией, способные прикрепляться к поверхности культурального пластика и формировать колонии in vitro, а также дифференцироваться в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях. Термин «стволовая клетка» (нем. Stammzelle) был предложен к широкому использованию русским гистологом А. А Максимовым в 1908. Он описал гемопоэтические стволовые клетки и доказал их существование методами своего времени, именно для них был введён термин. А. А Максимов во многом предопределил направление развития мировой науки в области клеточной биологии. Несколько позже, в 1970 году профессор московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи, А. Я. Фриденштейн изучал возможности этих особых клеток и подтвердил предположение коллеги. Оказалось, что клетки костного мозга, эксплантированные в культуру, жизнеспособны и могут длительно пролиферировать. Они обладали высокой эффективностью клонирования и способностью дифференцироваться в другие типы клеток мезодермы. Клетки, первоначально названные как образующие колонии фибробласты (CFU-F), позже получили название мезенхимных стромальных (стволовых) клеток (МСК). В более поздних работах также была продемонстрирована способность МСК дифференцироваться в клетки эндотелия, кардиомиоциты, нейроны и астроциты [1].

В целостном организме МСК выполняют гомеостатические функции и служат для восполнения утраченных элементов кровеносных сосудов и опорно-двигательного аппарата, для заживления ран, для построения сосудистой сети плода и плаценты. Осуществление перечисленных функций МСК обеспечивается экспрессией генов, кодирующих широкий спектр адгезионных молекул, цитокинов, хемокинов и их рецепторов [2].

С этими свойствами, а также с возможностью культивирования МСК in vitro, связано их интенсивное изучение и применение в качестве основы для клеточной терапии различных заболеваний [3].

Актуальность. Мезенхимальные стволовые клетки служат прекрасной моделью для исследования важнейших проблем клеточной биологии и биологии развития – таких как механизмы гистогенеза и регенерации тканей, пути регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки [1].

В настоящее время в исследовании МСК достигнут значительный прогресс: охарактеризованы профиль экспрессии генов и спектр продуцируемых цитокинов, исследовано влияние условий культивирования на пролиферацию и дифференцировку un vitro, выявлены сигнальные пути, контролирующие основные направления дифференцировки, частично раскрыты механизмы направленной миграции в поврежденные ткани и участия в их регенерации [5].

Клетки с характеристиками МСК обнаружены в большинстве тканей и органов как развивающегося, так и зрелого организма. По-видимому, они локализуются в соединительной ткани, сопровождающей кровеносные сосуды и, согласно мнению ряда авторов, представляют собой специализированные перициты или адвентициальные клетки. МСК различной органной локализации в целом сходны между собой по морфологии, иммунофенотипическим характеристикам и широте потенциала к дифференцировке[2].

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы в пределах одного исследования, с помощью стандартизованных методических приемов сравнить функциональные характеристики МСК, выделенных из костного мозга и жировой ткани мышей и изучение их биологических характеристик.

В соответствии с указанной целью в работе были поставлены следующие задачи:

1) Получить первичные культуры МСК из костного мозга и жировой ткани и сравнить свойства МСК, культивируемых в нормоксии и в гипоксии.

2) Сравнить ростовые характеристики и способность МСК к дифференцировке.

3) Сопоставить иммунофенотипические характеристики МСК, выделенных из указанных источников.

Обзор литературы

⇐ Предыдущая 123 4 Следующая ⇒