Высокоэффективная жидкостная

Хроматография

Сейчас в основном используется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). ВЭЖХ представляет собой хроматографирование на колонке под высоким давлением. Интерес к этому методу обусловлен следующими достоинствами: универсальность, возможность автоматиза-ции разделения и анализа сложных смесей, экспрессность, высокие эффективность и чувствительность.

Коэффициенты диффузии в жидкостях на несколько порядков ниже, чем в газах, поэтому вклад величины продольной диффузии в выражение для ВЭТТ ничтожен. Следовательно, исходя из кинетической теории, не должно существовать оптимальной скорости потока, при которой ВЭТТ была бы минимальной, и эффективность работы колонки с возрастанием скорости потока элюента должна резко ухудшаться.

Действительно, при работе с обычными сорбентами так оно и есть. Большая глубина пор сорбентов в классической ЖХ является основной причиной ее низкой эффективности. В ВЭЖХ широко применяются поверхностно-пористые сорбенты. Это твердые непористые сферические зерна, на поверхность которых нанесен тонкий (около 1 мкм) слой адсорбента с высокой пористостью. Реально это силикагель, оксид алюминия или некоторые полимеры, нанесенные на поверхность стеклянных микрошариков. Отсутствие глубоких пор приводит к уменьшению ВЭТТ и значительному увеличению эффективности колонки. Существуют и объемно-пористые сорбенты, размер их частиц (5-10 мкм) также намного меньше, чем размер частиц обычных сорбентов.

В настоящее время интенсивно развиваются различные варианты ВЭЖХ.

Адсорбционная хроматография.В адсорбционном варианте жидкостной хроматографии в зависимости от полярности ПФ и НФ различают нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографию. В НФХ используют полярные НФ и неполярные ПФ, а в ОФХ - наоборот. В обоих случаях выбор подвижной фазы часто важнее, чем выбор вещества неподвижной фазы. Обычно разделения достигают, меняя элюирующую силу ПФ. Элюирующая силапоказывает, во сколько раз энергия сорбции данного элюента больше, чем энергия сорбция элюента, принятого за стандарт. Различают слабые и сильные элюенты. Элюент тем сильнее, чем выше растворимость в нем анализируемой пробы. В НФХ элюирующая сила растет с увеличением полярности растворителя, в ОФХ – наоборот.

Распределительная хроматография.В этом варианте происходит распределение вещества между двумя несмешивающимися жидкостями в соответствии с растворимостями в них. В настоящее время используют, как правило, неподвижные фазы, химически привитые к поверхности неподвижного носителя.

Ионообменная, ионная, ион - парная хроматография. В основе этих методов лежит динамический процесс замещения ионов, связанных с НФ, ионами элюента, поступающими в колонку. Преследуемая цель - разделение органических и неорганических ионов с зарядом одного знака на ионообменниках.

Эксклюзионная хроматография- разделение компонентов основано на распределении молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим через колонку, в соответствии с их размером. В процессе разделения небольшие молекулы удерживаются сеткой полимера, а большие вымываются из колонки подвижной фазой. Вначале элюируются самые большие молекулы, затем средние, а потом - маленькие.

Краткая характеристика газовой хромотографии

Газовая хроматография может быть применена для разделения и определения смесей веществ, которые могут быть легко переведены в газообразное состояние при сравнительно невысоких температурах (обычно – не выше 250⁰С). Среди вариантов ГХ газо-жидкостный распространен несколько больше, чем газо-твердофазный.

Разделение компонентов смеси в газожидкостной хроматографии основано на различной растворимости (абсорбируемости) разделяемых компонентов в пленке неподвижной жидкой фазы. Растворимость газа в жидкости определяется законом Генри:

С_ж = K × C_г,

где С_ж и C_г - равновесные концентрации компонента в жидкости и в газовой фазе соответственно;

К - константа Генри.

Чем больше величина К, тем лучше растворим данный компонент. Выбор неподвижной жидкой фазы определяется природой разделяемых веществ. Так, при анализе углеводородов в качестве НФ обычно используют сквалан, при анализе ароматических и галогенирован-ных соединений - бензилдифенил, при анализе многих полярных веществ - полиэтиленгликоль. Через колонку непрерывно пропускают поток инертного газа-носителя (элюента). Выбор этого газа, в отличие от элюента в ЖХ, почти произволен.

В фиксированный момент времени в газ-носитель перед входом в колонку вводится небольшое количество анализируемой пробы. Газ-носитель увлекает ее и несет через колонку. Соприкасаясь с жидкостью, находящейся в колонке, компоненты пробы частично растворяются в ней. Поскольку через колонку непрерывно проходит газ-носитель, зона компонента движется по колонке. При этом в передней части зоны (фронт зоны) происходит абсорбция компонента, а в тыловой части зоны - десорбция.

Чем лучше данный компонент растворим в неподвижной жидкости, тем меньше скорость его движения по колонке. Иными словами, чем больше растворимость компонента, тем дольше он будет задерживаться жидкостью колонки. Поэтому зоны малорастворимых компонентов уйдут вперед, а зоны хорошо растворимых - отстанут. Таким образом, в колонке происходит разделение отдельных компонентов.

Аппаратура метода

Общая схема хроматографа

В настоящее время выпускается большое количество хроматографов, которые применяются в различных видах хроматографии. Несмотря на многочисленные усовершенствования, ключевые компоненты его конструкции неизменны (например, схема газового хроматографа представлена на рис. 8.40).

Основной узел хроматографа – колонка: именно в ней происходит процесс разделения. Количество вещества, выходящего из колонки, регистрируют с помощью детектора, а самописец (или дисплей) записывает на ленте (или экране) сигнал детектора - хроматограмму.

Самые современные хроматографы (основной производитель - зарубежные фирмы) включают в себя несколько колонок, набор различных детекторов, автоматическое устройство для подготовки и ввода пробы, а также компьютер. Он имеет банк данных, обеспечивающий аналитика обширной информацией.

Рис. 8.40. Блок-схема газового хроматографа:

1 – баллон с газом-носителем (элюентом); 2 – манометр; 3 – дозатор-испаритель;

4 – колонка; 5 – детектор; 6 – термостат; 7 – регистратор (самописец, компьютер)

Внедрение запоминающих устройств и мощных процессоров в настоящее время позволяет улучшить идентификацию и количественную обработку хроматографических пиков, а также дает возможность дальнейшего усовершенствования приборов. Для этого необходима строгая слаженность работы всей хроматографической системы: от ввода пробы до разумного выбора ПФ и детектора, а также полная автоматизация процесса, устраняющая субъективные ошибки и увеличивающая скорость обработки результатов.

Хроматографические колонки

Сердце хроматографа - хроматографическая колонка. Существуют два основных типа колонок: насадочные и капиллярные.

Насадочные (набивные) колонки для ГХ представляют собой стеклянные, пластмассовые или металлические трубки длиной от 1 до 50 м с внутренним диаметром от 1, 5 до 6 мм. Более длинные колонки обеспечивают лучшее разделение, но приводят к некоторым осложнениям в работе, в частности, из-за возникающих перепадов давления. Колонки заполнены " насадкой" - твердым сорбентом или твердой основой с нанесенной на неё неподвижной жидкой фазой. Инертный твердый носитель имеет средний диаметр зерен около 160 мкм. Поскольку жидкая пленка неравномерно распределена на носителе, не имеет смысла говорить о ее толщине. В аналитических колонках на 100 г твердого носителя приходится от 0, 5 до 5 г жидкой неподвижной фазы.

Можно использовать саму стенку колонки как твердую основу. Тогда речь идет о капиллярной колонке. В них используется нанесение на стенку длинного капилляра из металла, нейлона или кварцевого стекла (как правило, длиной 10 - 100 м) тончайшего слоя неподвижной фазы. Эта технология позволила существенно улучшить параметры разделения смесей. Диаметр капиллярных колонок мал (до 0, 25 мм). Существует несколько способов нанесения внутреннего покрытия колонок. Например, около 1 % длины колонки заполняют 10 %-ным раствором НФ в летучем растворителе, продувают эту жидкость через капилляр (при этом тонкий слой остается на стенках) и удаляют избыток растворителя струей газа.

В последнее время в аналитической практике всё большее распространение получают именно капиллярные колонки высокого разрешения. Появились капиллярные колонки с нанесенной на внутреннюю поверхность не только жидкой, но и твердой фазой. Капиллярные колонки существенно эффективнее насадочных, главным образом потому, что в них гораздо меньше возможностей для размывания зон вследствие вихревой диффузии. Они позволяют проводить разделение более полно за меньшее время и часто при меньшей температуре. С другой стороны, поскольку количество НФ на стенках такой колонки невелико, и масса анализируемого образца должна быть небольшой (часто менее 1 мкг). Это предъявляет высокие требования к отбору пробы, детектору и регистрирующему устройству.

Работа колонок характеризуется селективностью (т.е. способностью разделять компоненты смеси) и эффективностью (быстротой и полнотой этого разделения). Наиболее наглядно это может быть проиллюстрировано различными идеализированными хроматограммами смеси двух веществ (рис.8.41).

На рис.8.41а хорошо видно, что смесь двухкомпонентная, но зоны веществ накладываются друг на друга (разделение неполное), и проводить анализ затруднительно. Случай на рис. 8.41б также неудовлетворителен: размывание зон минимально, но сродство обоих компонентов к используемой НФ почти одинаково. Необходимо так подбирать колонку и условия разделения, чтобы получать острые, хорошо разделенные пики (рис. 8.41 в).

Рис.8.41. Хроматограммы смеси двух веществ:

а) высокая селективность, но плохая эффективность,

б) высокая эффективность, но плохая селективность,

в) высокие селективность и эффективность

Температура колонок определяется исключительно летучестью пробы и может изменяться от –196 до 350⁰ С. Для поддержания постоянной температуры разделяемой газовой смеси (до ±0, 05⁰С) колонки помещают в термостаты различной конструкции, что, естественно, усложняет хроматографическую установку и существенно увеличивает ее стоимость. Современные приборы дают возможность изменять температуру колонки в процессе хроматографирования по определенной заданной программе.

Детекторы

Хроматография - гибридный аналитический метод, в котором сочетаются разделение и измерение. Метод позволяет разделять многокомпонентную смесь, идентифицировать компоненты и определять ее количественный состав. Поэтому детектирование сигнала (а также запись и обработка его) играет важную роль.

Детектор – прибор, как правило, непрерывного действия, дающий аналитический сигнал на определяемые вещества. Аналитический сигнал возникает за счет фиксирования детектором изменения какого-либо свойства ПФ при попадании в нее исследуемого вещества. Детекторы классифицируют по различным признакам.

1) Они могут быть: универсальными - регистрирующими многие вещества; селективными - чувствительными к химическим соединениям определённых классов; специфическими - обладающими очень высокой селективностью.

2) по способу записи хроматограмм детекторы делятся на:

интегральные (такие детекторы регистрируют суммарное количество компонента, вышедшего из колонки за определенный промежуток времени);

дифференциальные (мгновенно регистрирует изменение какого-либо свойства, связанного с появлением вещества в ПФ).

Любой детектор характеризуется следующими параметрами:

1) чувствительность - отношение сигнала детектора к количеству обнаруженного им вещества: чем больше это отношение, тем выше чувствительность детектора;

2) воспроизводимость результатов - количественной мерой служит стандартное отклонение серии сигналов при вводе в хроматограф одних и тех же проб;

3) стабильность работы - низкая чувствительность к колебаниям температуры и скорости потока ПФ;

4) предел обнаружения (детектирования) - минимальное определяемое количество вещества, которое вызывает сигнал (h), равный удвоенному (иногда утроенному) сигналу шума (N):

5) диапазон линейности сигнала - интервал линейной зависимости величины аналитического сигнала от концентрации вещества в пробе. Каждый детектор имеет линейный сигнал лишь в определенном диапазоне концентраций.

Кроме того, к детекторам предъявляются вторичные требования: они должны быть простыми по устройству, удобными в использовании, безопасными в работе, надежными и доступными.

В различных видах хроматографии применяют разные типы детекторов. Так, например, для газовой хроматографии описано несколько десятков детекторов, но в комплектацию прибора входят обычно 4-6. Наиболее широко используются универсальные детекторы - катарометр и пламенно-ионизационный детектор (ПИД), а также селективные - электронного захвата и пламенно-фотометрический. В жидкостной хроматографии чаще всего используются спектрофотометрические, люминесцентные и электрохимические (кондуктометрический, полярографический) детекторы. Охарактеризуем некоторые детекторы для ГХ.

Детектор по теплопроводности (катарометр). Этот универсальный детектор ранее наиболее широко применялся в газовой хроматографии. Он устроен следующим образом: в полость металлического блока помещается спираль из металла, обладающего высоким термическим сопротивлением (это могут быть Pt, W, их сплавы, Ni).

Через спираль проходит постоянный ток, и она нагревается. Если в катарометр поступает только газ-носитель, происходит теплообмен между ним и спиралью и, следовательно, её температура остается постоянной. При изменении состава газа меняется теплопроводность газа и соответственно температура спирали. Все это приводит к изменению сопротивления нити, которое измеряют с помощью моста Уитстона (рис. 8.42).

В этой схеме – две идентичные камеры, в одну из которых поступает газовая смесь из колонки, а в другую (сравнительную) –чистый газ-носитель из баллона. Когда через обе камеры проходит газ-носитель, детектор настраивают на нуль. При появлении в рабочей камере компонентов смеси наступает разбалансировка моста, и фиксирующее устройство регистрирует выходную кривую.

Понятно, что чувствительность катарометра зависит от того, насколько теплопроводность веществ отличается от таковой для газа-носителя. Следовательно, наиболее выгодно использовать этот детектор с газом-носителем, теплопроводность которого сильно отличается от теплопроводности большинства других газов. Этим газом является гелий (диапазон линейности катарометра в таком случае – до 5 порядков концентрации). Поскольку гелий не так дешев, как, например, часто применяемый азот, чувствительность не относится к числу преимуществ катарометра. Его главное достоинство – в универсальности.

Рис.8.42. Схема катарометра

Пламенно-ионизационный детектор (ПИД). В этом детекторе выходящий из колонки газ смешивается с водородом и поступает в форсунку горелки, где образуются ионизированные частицы. Последние заполняют межэлектродное пространство детектора, вследствие чего электросопротивление пламени уменьшается, а ток резко усиливается. С помощью ПИД можно определять только соединения, которые ионизируются в пламени, т.е. углеродсодержащие соединения с С – С и С – Н – связями. Стабильность и чувствительность ПИД зависит от подходящего выбора скорости потока всех используемых газов, а поскольку он имеет широкую область линейного отклика, то пригоден для определения следовых количеств веществ.

Детектор электронного захвата (ЭЗ). Принцип действия этого детектора основан на том, что многие молекулы могут реагировать с электронами с образованием стабильных анионов.

Этот детектор может быть использован для обнаружения соединений, содержащих галогены, фосфор, серу, нитраты, свинец, кислород, но на большинство углеводородов он не реагирует.

Он представляет собой ионизационную камеру (рис.8.43), куда из хроматографической колонки поступает газ-носитель (N₂, He). В камере находятся два электрода и источник b-излучения (⁶³Ni, ³H, ²²⁶Ra, чаще - титановая фольга с адсорбированным тритием). Под действием радиоактивного излучения в камере происходит ионизация молекул газа-носителя, например , и образуются медленные электроны. Эти электроны перемещаются к аноду, вследствие чего возникает ток. При попадании в детектор молекул анализируемых веществ медленные электроны захватываются ими, при этом ток детектора уменьшается.

Рис. 8.43. Схема детектора

электронного захвата.

1 - ввод газа;

2 - источник излучения;

3 - вывод в атмосферу;

4, 5 - электроды

Атомно-эмиссионный детектор. Этот детектор пока еще встречается довольно редко: попытки подключения атомно-эмиссионного спектрометра к газовому хроматографу долгое время не давали результатов. Принцип работы детектора состоит в том, что после распыления образца атомы в нем возбуждаются до более высокого энергетического уровня, а затем, возвращаясь в исходное состояние, излучают свет с характеристичными длинами волн.

Для возбуждения атомов используется плазма, индуцированная микроволновым излучением. В состав спектральной схемы детектора входит дифракционная решетка. Регистрация аналитического сигнала происходит на компьютере.

Атомно-эмиссионным детектором НР5921А может быть обнаружено более 40 элементов, в том числе различные изотопы углерода, водорода, кислорода и азота. Пределы обнаружения большинства элементов находятся на уровне 0, 1 – 20 пкг/с, диапазон линейности 3 – 4 порядка концентрации. Детектор селективен: при настройке его на определенную длину волны определению не мешают 1000 – 10000-кратные избытки других элементов.

Практические трудности состоят в том, что для создания плазмы должен использоваться очень чистый гелий (он же – и газ-носитель): степень его чистоты не ниже 99, 9999 %.

Пламенно-фотометрический детекторизмеряет интенсивность излучения веществ в водородном пламени (т.е. работает по принципу пламенно-эмиссионного фотометра). При сгорании веществ образующиеся атомы возбуждаются, а при возвращении в исходное состояние испускают характеристичное излучение. Оптические фильтры, используемые в детекторе (обычно – интерференционные), выделяют спектральные линии, характерные для определенных соединений. Детектор наиболее чувствителен к фосфорсодержащим и серосодержащим веществам (длины волн соответственно 526 и 394 нм). Излучение принимается и усиливается фотоумножителем.

Использование такого селективного детектора часто снижает необходимость в трудоемких операциях по подготовке образцов к измерениям. Однако характер химических реакций, происходящих в пламени, находится в сложной зависимости от скорости потока газов и температуры. Вследствие этого интенсивность излучения связана с концентрацией не линейно, а приблизительно пропорциональна квадрату ее. Тем не менее, измерительная схема детектора позволяет поддерживать линейность отклика в диапазоне 10³ для соединений серы и 10⁴ – для фосфора при пределах обнаружения 20 и 0, 9 пкг соответственно. Не мешают 10000-кратные избытки других соединений.

Наиболее важными параметрами, влияющими на стабильность работы детектора и его чувствительность, являются соотношение водорода с воздухом (или кислородом) и температура головки детектора.

Масс-селективный детектор. Масс-селективный детектор для ГЖХ имеет ряд преимуществ по сравнению с другими видами детекторов. Он позволяет не только идентифицировать исследуемое соединение по времени удерживания на хроматографической колонке, но и сравнивать его масс-спектр с масс-спектром эталонного образца. Кроме того, при отсутствии стандарта данный метод позволяет идентифицировать соединение путем сравнения спектров исследуемого соединения со спектрами, имеющимися в библиотеке данных, так как параметры масс-спектра в меньшей степени зависят от вторичных факторов, чем время удерживания (последний параметр может зависеть даже от времени эксплуатации колонки, поэтому стандарт в данном случае необходим).

Следует отметить, что при помощи ГЖХ с масс-селективным детектором можно работать и с ранее неизвестными соединениями. В этом случае по данным хромато-масс-спектрометрии можно анализировать сложные реакционные смеси, где находятся продукты неизвестной этиологии, что создает перспективу при проведении научно-исследовательских работ.

Кроме того, при исследовании образцов, где трудно представить примерный состав анализируемой пробы, данный метод будет незаменимым.

Если сравнивать хромато-масс-спектрометрию и масс-спектрометрию, то можно выделить следующие основные отличия методов:

- в хромато-масс-спектрометрии более часто проявляется молекулярный ион, чем в масс-спектрометрии, так как хроматографическому анализу обычно подвергаются соединения, которые способны переводиться в газообразную фазу и являются относительно стабильными;

- при помощи масс-спектрометрии можно анализировать соединения с гораздо большей молекулярной массой, чем при помощи хромато-масс-спектрометрии;

- при помощи масс-спектрометрии можно анализировать только индивидуальные соединения, а не сложные смеси, как в хромато-масс-спектрометрии;

- масс-селективный детектор является (как правило) более примитивным прибором, чем специализированные масс-спектрометры, и в нем ионизация образца происходит под действием электронного удара;

- к недостаткам ГЖХ с масс-селективным детектором можно отнести все недостатки хроматографического метода анализа, так как анализируемый образец попадает в масс-спектрометр только после прохождения через хроматографическую колонку;

- при помощи масс-селективного детектора (как правило) нельзя получать масс-спектры высокого разрешения;

- при помощи масс-селективного детектора (как правило) нельзя проводить элементный анализ образца.

Таким образом, использование ГЖХ с масс-селективным детектором наиболее целесообразно для исследования образцов, в которых могут содержаться неизвестные или труднодоступные соединения, то есть где возникают трудности с получением стандартных образцов.

⇐ Предыдущая 72 73 74 75 767778 79 80 81 Следующая ⇒