Маниатис Т., Фритч И., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.

Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

Великов В.А. Молекулярная биология. Практическое руководство. Саратов: Изд-во Саратовский источник, 2013

(+ LAP ).

Великов В.А. Кузнецов П.Е. Молекулярная биология. Методы биоинженерии / Под ред. В.В. Игнатова. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006;

Великов В.А. Игнатов В.В. Практикум по молекулярной биологии. Методы исследования белков. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2007;

Практикум по молекулярной биологии: методы ДНК-диагностики: учебно-методическое пособие / В. А. Великов, В. В. Аникин; Саратовский гос. ун-т им. Н. Г. Чернышевского. - Саратов: Наука, 2008 (Саратов: Саратовский источник). - 48 с.: ил.; 21 см.; ISBN 978-5-91272-615-6

MOLBIOL.RU – Классическая и молекулярная биология (http: //www.molbiol.ru).

Практическая молекулярная биология (http: // www.molbiol. edu.ru ).

National Center for Biotechnology Information / US National Library of Medicine (http: //www.pubmed.com).

Белясова Н. Биохимия и молекулярная биология. М.: Книжный дом, 2004.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1. Характеристика векторных плазмид и бактериофагов

Наименование	Маркер	Размер	Число копий на клетку E.coli	Характеристика
pBR322	Ap^r Tc^r	4, 4 kb	≈ 20	Рекомбинантная плазмида. Один из первых векторов молекулярного клонирования
p Bluescript II	Ap^r	2, 96 kb	до 300	Вектор для клонирования и секвенирования. Фагмида. Имеет ori фага M13 и ген lacZ
M 13	–	6, 4 kb	≈ 100	Нитевидный фаг дикого типа с одноцепочечной ДНК. Умеренный. Заражает только F+ клетки E.coli
M 13 K 07	Km^r	6, 5 kb	≈ 100	Рекомбинантный фаг-помощник. Имеет ген канамицин-устойчивости. Дефектен по упаковке в вирионы
M13 mp18	–	7, 25 kb	≈ 100	Фаговый вектор для клонирования и секвенирования. Имеет MCS.
l (Lambda)	–	48, 5 kb	≈ 100	Лизирующий фаг с двухцепочечной ДНК, упакованной в белковый капсид икосаэдрической формы. Дикий тип. Способен переходить в лизогенное состояние
pSUP106	Cm^r Tc^r	9, 6 kb	до 40	Вектор широкого круга хозяев. Плазмида. Поддерживается в клетках многих грам-отрицательных бактерий
pSUP106:: sacB	Cm^r Km^r	14, 4 kb	до 40	Содержит встроенную по BamH1- сайту 3, 8 kb кассету (конструкт) с геном левансахаразы sacB из бактерии Bacillus subtili s
pHEN1	Ap^r	4, 5 kb	≈ 100	Вектор для фагового дисплея антител. Фагмида. Способен упаковываться в вирионы в присутствии в клетках фага-помощника M13 K07
pHEN1:: scFv	Ap^r	5, 4 kb	≈ 100	Содержит клонированный ген scFv, кодирующий синтез одноцепочечных рекомбинантных миниантител определенной специфичности
pET30	Km^r	5, 4 kb	≈ 100	Плазмида-вектор для экспрессии белков. Имеет промотор РНК-полимеразы фага Т7

Примечание. Ap^r – устойчивость к ампициллину, Km^r – устойчивость к канамицину, Cm^r – устойчивость к хлорамфениколу, Tc^r – устойчивость к тетрациклину

Приложение 2. Характеристика штаммов бактерий, приведенных в руководстве

Штамм	Генотип	Характеристика
Escherichia coli XL1– Blue	recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacI^qZ M15 Tn10(Tet^R)]	Широко используемый штамм-хозяин для различных векторов
E.coli TG1	supE thi-1 (lac-roAB) (mcrB–hsdSM)5(r_K- m_K-) [F' traD36 proAB lacI^qZ M15]	Штамм-хозяин для нитевидных фагов, удобен для нарабоки фаговых (и фагмидных) частиц
E.coli JS5	a ra D139 D(ara leu) 7967 D (lac) x74 galU galK hsdR12 (rk^–mk^–) mcrA mcr BC rpsL (Str^R) thi rec A1 [F^’:: Tn10 (Tet^R)proAB lac I^q LacZ M15]	Штамм-хозяин для нитевидных фагов и фагмид, удобен для наработки «растворимых» одноцепочечных рекомбинант-ных миниантител scFv
E.coli BL21(DE3)	F^– dcm ompT hsdS(r_B– m_B–) gal (DE3)	Штамм-хозяин для экспресcии рекомбинантных белков с помощью T7 РНК-полимеразы (на векторе необходим Т7 промотор)
E.coli BL21(DE3) pLysS	F^– ompT hsdS(r_B– m_B–) gal dcm (DE3) [pLysS Cm^R]	Содержит плазмиду pLysS с геном синтеза ингибитора T7 РНК-полимеразы, обеспечиваю-щим отсутствие «фоновой» экспрессии, если нет индукции
Agrobacterium tumefaciens C58	Штамм дикого типа, прототроф, почвенный изолят	Модельный штамм для изучения механизмов трансгеноза растений
Erwinia carotovora B15	Штамм дикого типа, прототроф, почвенный изолят	Фитопатогенный микроорганизм (мягкая гниль картофеля)

Приложение 3. Сайты узнавания некоторых рестриктаз

Фермент

Сайт узнавания и точка

разрезания (указана стрелкой)

Количество сайтов в ДНК

pBR322

M13 mp18

Lambda

BamHI

G^↓GATCC

BglII

A^↓GATCT

–

SauIIIA

^↓GATC

EcoRI

G^↓AATTC

EcoRII

^↓ CC(A/T)GG

EcoRV

GAT^↓ATC

–

HindIII

A^↓AGCTT

KpnI

G^↓GTACC

–

NotI

GC^↓GGCCGC

–

PstI

CTGCA^↓G

SmaI

CCC^↓GGG

–

XhoI

C^↓TCGAG

–

Приложение 4. Рестрикционная карта плазмиды pBR322

Обозначения:

rep (pMB1)	– ori репликации плазмиды pMB1 (ориджин, точка начала репликации, репликон),
bla (Ap^r)	– ген устойчивости (резистентности) к ампициллину ( b-лактамаза),
tet (Tc^r)	– ген устойчивости к тетрациклину,
rop	– область контроля копийности.

Цифры возле обозначения сайтов узнавания рестриктаз соответствуют номеру первого нуклеотида в сайте. Отсчёт ведётся от первого нуклеотида Т в сайте узнавания рестриктазы EcoRI. Показаны только уникальные сайты, причём для небольшого числа из множества рестриктаз, способных гидролизовать ДНК плазмиды pBR322 (≈ 50).

Ген устойчивости к ампициллину (полусинтетический антибиотик из группы пенициллинов, лактамное кольцо которого способна разрушать b-лактамаза) инактивируется при клонировании ДНК по сайту рестриктазы PstI. Ген устойчивости к антибиотику тетрациклину, кодирующий защитный белок – по сайту рестриктазы BamHI. Инсерционная инактивация этих генов при вставке « чужеродной ДНК » позволяет выявлять рекомбинантные плазмиды, поскольку у трансформированной такой плазмидой клетки исчезает устойчивость к тому или другому антибиотику, в то время как ко второму антибиотику сохраняется.

Приложение 5. Рестрикционная карта фагмиды pBluescript ® II ( Stratagene)

rep (pMB1)	– ori репликации плазмиды pMB1 (репликон ColE1-типа),
bla (Ap)	– ген устойчивости к ампициллину ( b-лактамаза),
f1 (IG)	– ori репликации фага М13,
LacZ	– ген b-галактозидазы, N-концевая часть,
P_T3	– промотор фага Т3,
P_T7	– промотор фага Т7,
MCS	– полилинкер, мультиклональный сайт ( Multiple Cloning Site).

Порядок расположения сайтов рестрикции в полилинкере плазмиды pBluescript II SK(+)

, начиная от промотора P_T7(ориентация полилинкера):

KpnI, XhoI, SalI, HindIII, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, XbaI, NotI, SacI;

и для плазмиды pBluescript II KS(+)

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 6 789 10 11 Следующая ⇒