Расчёт температуры отжига праймера

Для точного расчёта оптимальной температуры существует множество программ и алгоритмов. Упрощенный расчёт можно провести по формулам:

T_а = [(A+T) ´ 2°C]+[(G+C) ´ 4°C]  (если длина ≤ 20 оснований)

T_а = 22+1, 46 ([2 ´ (G+C)]+(A+T)]  (если длина составляет 20–30 оснований)

 

Примечания  

^а  Не забывайте об антипараллельности цепей ДНК при подборе обратного праймера. Если он будет иметь нужный состав, но другую полярность, то ПЦР-продукт получен не будет. Такой праймер (параллельный) не будет отжигаться на матрицу, т.е. образование гибридного комплекса олиго-/полинуклеотид невозможно.

^б Олигонуклеотид любого состава может быть по заказу синтезирован специализированной фирмой. По желанию заказчика в его состав введут флуоресцентную метку. На его 5’-конец при заказе можно добавить какие-либо нуклеотиды, к примеру, нуклеотиды сайта узнавания определённой рестриктазы. Компания примет заказ и на сиквенс полученного ПЦР-продукта: праймер для его секвенирования уже есть в наличии.

 

 

Работа 6.2. Проведение ПЦР-амплификации ДНК

ПЦР проводится в объёме 10–50 мкл. Рабочая концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 0, 2–1 пМ/мкл. Количество матричной ДНК, добавляемой в реакцию, колеблется в пределах от 10 нг (плазмидная ДНК) до 1000 нг (геномная ДНК). Рабочая концентрация Taq-полимеразы составляет 0, 01–0, 05 ед/мкл. Число циклов – 30. Считается, что скорость достраивания ДНК Taq-полимеразой при ПЦР составляет 1000 нуклеотидов в минуту.

 

Оптимальная концентрация праймеров часто подбирается эмпирически (расчёт см. в раб. 6.3). Не рекомендуется брать больше чем 50пМ на пробу, иначе возможен неспецифический отжиг и образование праймер-димеров.

 

Обычно задают следующий режим работы ДНК-амплификатора:

 

1. T_d = 95^oC, от 1 мин  – предварительная денатурация матрицы, один этап

 

2. 25–30 циклов ПЦР:

   T_d = 95 ^o C, от 10 с   – денатурация     (denaturation)

   T_a = 50 – 65 ^o C, от 30 с – отжиг праймеров    (annealing)

   T_e = 72 ^oC, от 1 мин – элонгация, полимеризация   (elongation, extension )

3. T = 72^oC, от 1 мин.  – достройка незавершенных цепей, один этап

4. T = 4^oC.                     – режим хранения

 

В качестве примера приведён протокол ПЦР-амплификации митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского (Великов с соавт., Вестник Саратовского госагроуниверситета, 2006, №3).

 

Материалы и оборудование

ПЦР-амплификатор, ДНК (общая) гадюки Никольского Vipera nikolskii(40 нг/ мкл), праймеры (10 пМ/мкл), смесь нуклеотидов dNTP- mix (2мМ), раствор хлорида магния (25мМ), Taq-полимераза (5 ед/мкл), 10x ПЦР-буфер.

Растворы

- Реакционная смесь.Подготовка смеси в конечном объёме 20 мкл:

1. 10´ ПЦР-буфер(200мМ Tris–HCl, pH 8, 4; 500мМ КCl; 0, 01% Тween 20) – 2 мкл;

2. 2мМ dNTP mix(смесь из всех 4-х дезоксирибонуклеозидтрифосфатов c концентрацией по 2 мМ каждого) – 2 мкл;

3. 25мМ раствор MgCl₂ – 2 мкл;

4. Праймер ND2 For:   5^’– GCATTTTCATGACCACCACC –3^’  – 2 мкл;

5. Праймер ND2 Rev:  5^’– GAGTGAGGGGTAAGATAGTG –3^’  – 2 мкл;

6. ДНК-мишень: общая ДНК гадюки Никольского(40 нг/мкл) – 3 мкл;    

7. Вода деионизованная – 6, 8 мкл;

8. Ta q -полимераза – 0, 2 мкл.

Методика

1. В стерильной пластиковой тонкостенной пробирке на 0, 5 (0, 2) мл смешать указанные выше компоненты, довести объём при помощи деионизованной воды до 20 мкл. Фермент добавлять последним, сразу убрать на –20°С!

2. Центрифугировать 15 с. Нанести поверх реакционной смеси немного минерального масла для предотвращения испарения ( ≈ 30 мкл пипеткой или каплей). Если ДНК-амплификатор имеет нагреваемую крышку, то масло добавлять не нужно. Поместить пробирки в ДНК-амплификатор.

3. Запустить следующий режим ПЦР: предварительная денатурация матрицы при 95°С – 5 мин, затем 30 циклов амплификации: 95°С – 30 с, 57°С –       30 с, 72°С – 1 мин, затем задать температуру 72°С – 5 мин (окончательная достройка цепей) и вывести на +4°С – режим хранения. Расчётная температура отжига обоих праймеров соcтавляет 60°С, реальная задана на 3°С ниже для гарантии отжига и последующего «удлинения праймера».

4. Провести электрофорез ДНК, сфотографировать гель(фотографию электрофореграммы см. в прил. 11, размер ампликона 911 п.н.). При Real-Time PCR форез не проводят, за процессом следят по флуоресценции.

Работа 6.3. Расчёт праймеров и параметров ПЦР с помощью специальных программ

Имея некоторый опыт в постановке ПЦР в целях экономии времени для подбора праймеров можно использовать коммерческие программные продукты, а также интернет-ресурсы. Аналогично можно произвести другие расчёты, связанные с ПЦР. В частности сайт MOLBIOL.RU – это професси-ональная интернет-территория для русскоязычных молекулярных биологов, генетиков, биохимиков, биофизиков, биоинженеров (http: //www.molbiol.ru). Выложенная на сайте специальная форма поможет рассчитать параметры ПЦР, программы для подбора праймеров на сайте нет. 

 

Рассчитать (подобрать) праймеры для ПЦР-амплификации конкретной ДНК можно с помощью других интернет-ресурсов. В частности, можно использовать программу Primer3 (http: //frodo.wi.mit.edu) или другие.

В приведённой ниже работе предлагается ознакомиться с интернет-порталами, где можно произвести расчёты для ПЦР (англ. PCR – Polymerase Chain Reaction), т.е. получить практические навыки в работе c программами.

Ход работы

1. Откройте сайт программы Primer3 (http: //frodo.wi.mit.edu). Введите в специальное окно нуклеотидную последовательность гена НАДН-дегидрогеназы гадюки обыкновенной (источник – http: //www.pubmed.сом).

2. Нажмите «Pick Primers» и программа подберёт вам несколько пар праймеров. Длина ПЦР-продукта, или ампликона, при этом составит около 200 п.н. Это удобно для выявления какой-либо ДНК, но не подходит для работ, когда нужен полноразмерный ген или конкретный участок гена.

3. Проанализируйте подобранные пары праймеров и выберите на ваш взгляд наиболее подходящую пару, предложенную по умолчанию.

4. Задайте длину амплифицируемого участка ДНК, к примеру, 851–1000 п.н. и подберите праймеры. Узнайте, сколько нуклеотидов потеряет ампликон.

5. Задайте один из праймеров, к примеру, праймер ND 2 For из работы 6.2 и рассчитайте второй. Для этого вставьте последовательность праймера в специальное окно и нажмите «Pick Left Primer».

6. Проделайте те же операции с праймером ND 2 Rev и после этого со своими праймерами, подобранными «вручную» ранее (работа 6.1).

7. Задайте дополнительные требования к праймерам и проведите расчёт.

8. Откройте главную страницу сайта MOLBIOL.RU (http: //www.molbiol.ru). На главной странице найдите раздел «Расчёты», выберите пункт «Расчёт параметров ПЦР».

9. Вводя в специальные окна варьирующие параметры, такие как длина ПЦР-продукта, молярное количество праймеров, Taq-полимеразы и другие параметры рассчитайте, сколько нуклеотидов израсходуется в реакции и каков возможный максимальный выход ПЦР-продукта. Определите число циклов достаточное для завершения реакции при «идеальном» удвоении.

10. Ознакомьтесь с комментариями к расчётам. Обратите внимание на то, что расчёт ведётся для идеальных условий, когда в качестве матрицы берётся 0, 5 мкг геномной ДНК человека. Эти данные носят оценочный характер.

 

 

Тема 7. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ

Клонирование гена – это получение содержащего рекомбинантную ДНК клона бактерий или дрожжей, из клеток которого можно выделять ДНК конкретного гена и продукт этого гена (целевой белок) в значительных количествах.

Клонирование генов – основа генной инженерии или технологии рекомбинантной ДНК, как её назвали основатели. Общеизвестно прикладное значение этой технологии, однако, её значение для фундаментальной науки не меньше: видна коллинеарность ДНК и белка. Эту технологию изначально называют молекулярным клонированием, поскольку изолированная из генома конкретная ДНК обеспечивает синтез белковых молекул только одного типа. В сравнении с геномной ДНК это отдельный молекулярный клон, отдельная «молекулярная машина» по производству белка. При генной терапии или трансгенозе растений и животных всегда используют гены, вначале клонированные в клетках бактерий (дрожжей). Рекомбинантную ДНК впервые получил Пол Берг с сотр. (Berg et al., 1972).

 

Клонирование гена проводят путем его включения в вектор. Вектор – это кольцевая молекула ДНК (плазмиды, вируса, бактериофага), способная к авттономной репликации в выбранной системе клеток. ДНК гена и вектора, гидролизованные одной рестриктазой с образованием комплементарных «липких концов», ковалентно соединяют в одну кольцевую молекулу с помощью фермента ДНК-лигазы.

 

Полученную в реакции лигирования рекомбинантную ДНК вводят в клетки бактерий, где она может реплицироваться автономно, т.е. независимо от хромосомы и в большом числе копий. Фагмида pBluescript II, к примеру, может присутствовать в каждой клетке популяции E. coli в количестве 300 копий. Культивируя клетки полученного клона-продуцента можно получать нужный белок в неограниченных количествах. Это, по определению, неисчерпаемый ресурс. Употребляя термин «суперпродуцент» подчеркивают высокий уровень синтеза клеткой-хозяином целевого белка.

 

Стратегия клонирования для каждого конкретного гена разрабатывается индивидуально. Правильно разработанная стратегия определяет половину успеха (подбор вектора и необходимых рестриктаз, система отбора, скрининг клонов, предварительная изоляция гена и многое другое).

 

Процедуру клонирования можно разбить на несколько этапов:

 

* подготовка ДНК вектора (рестрикция),

* подготовка ДНК гена (рестрикция, ПЦР, синтез гена),

* лигирование ( « сшивание » ) ДНК генаи вектора,

* трансформация клеток E.coli продуктами лигазной реакции,

* отбор трансформированных клонов E.coli,

* проверка отобранных клонов на наличие вставки ДНК гена в векторе,

* проверка экспрессии клонированного гена.

                                                                              

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: