Общая схема молекулярного клонирования представлена в прил. 14.

Появление метода ПЦР существенно упростило задачу клонирования генов, поскольку позволяет изолировать и накопить ДНК интересующего гена ещё до стадии лигирования с векторной ДНК, а не искать нужный клон в библиотеке генов организма в E. coli; скрининг клонотеки – задача не из лёгких, которая под силу только опытному исследователю. По сути дела при ПЦР и получаются миллионы молекулярных клонов какого-то участка ДНК, разве что дальше размножаться, а главное экспрессироваться эта ДНК не может без включения в вектор и введения в клетку.

 

Гены с известной (! ) первичной структурой также можно «собрать» in vitro из синтетических олигонуклеотидов. При ПЦР нужно знать или верно предполагать только нуклеотидные последовательности праймеров.

Работа 7.1. Подготовка ДНК вектора и гена

Кольцевую ДНК вектора расщепляют рестриктазой по какому-либо уникальному, т.е. единственному на молекулу ДНК сайту в полилинкере.Полилинкер илимультиклональный сайт имеет нуклеотидные последовательности сайтов узнавания для нескольких рестриктаз (прил. 5). ДНК гена также «вырезают» из хромосомы с помощью этой же выбранной рестриктазы, чтобы получить комплементарные липкие концы.

 

В случае клонирования ПЦР-продукта к нему с помощью особого фермента присоединяют липкие концы из адениловых нуклеотидов PolyA и применяют PolyT -вектор pAL-TA^TM (Евроген). Новый метод ферментативных ассамблей перекрывающихся фрагментов ДНК (Gibson assembly, 2009) позволяет лигировать нерестрицированную ДНК, в том числе ПЦР-продукты.

 

В работах 7.1 – 7.3 в качестве несложного примера приведена схема клонирования (точнее переклонирования) гена левансахаразы sacB сенной палочки Ваcillus subtilis в вектор pBluescript II из рекомбинантной плазмиды pSUP106:: nptI-sacB-sacR (Великов с соавт., Биотехнология, 2004, Т.3).

Материалы и оборудование

Рестриктаза BamHI, ДНК фагмиды pBluescript II SK+ (1 мг/мл) или штамм E. coli c указаной фагмидой, ДНК плазмиды pSUP106:: nptI - sacB - sacR (1 мг/мл) или штамм E. coli с этой плазмидой, плотная фильтровальная бумага.

Растворы

-10´ буфер для рестриктазы BamHI (тема 4).

Протокол

Подготовка вектора

 

1. Нарастить биомассу клеток штамма-хозяина E.coli XL1–Blue, содержащего вектор pBluescript II SK+ в объёме 500 мл питательной среды.

2. Провести препаративное выделение плазмиды, как описано в теме 4.

3. Провести рестрикцию 2 мкг ДНК вектора рестриктазой BamHI (тема 5).

4. Провести электрофорез для контроля полноты рестрикции после 1 ч инкубации. На геле должна быть видна только одна полоса размером около 3 kb. Свечение нескольких полос свидетельствует о неполном гидролизе. В этом случае следует продолжить реакцию ещё в течение 1 ч.

5. Переосадить гидролизованную ДНК этанолом и растворить в 20 мкл деионизованной воды. Обрабатывать вектор щелочной фосфатазой CIP для предотвращения лигирования вектора «самого на себя» необязательно, так как отбор будет вестись по маркеру кассеты – на канамицин-устойчивость.

6.

Подготовка гена

1. Вырезать кассету nptI-sacB-sacR по сайту BamHI из рекомбинантной плазмиды. Для этого провести рестрикцию 1 мкг плазмиды         pSUP106:: nptI-sacB-sacR подобно тому, как описано в теме 5.

2. Провести электрофорез ДНК в агарозном геле.

3. Вырезать под УФ светом ^а из геля скальпелем полоску агарозы с фрагментом ДНК, соответствующим по размеру кассете, или конструкту, как его называют ещё. Это нижняя полоса на геле с размером 3, 8 kb, верхняя полоса размером 9, 6 kb – это вектор pSUP106.

4. Выделить ДНК кассеты из вырезанной полоски геля ^б с помощью коммерческого набора DNA Extraction Kit (Fermentas ^TM, Thermo Scientific Life Science Research ) или каким-либо другим известным способом ^в. Приемлемый выход ДНК (до 50%) получается при центрифугировании кусочка геля, помещенного в кулёчек из плотного фильтра внутри проколотой пробирки, вставленной в другую пробирку. Агароза остаётся на фильтре, а раствор ДНК попадает в нижнюю пробирку.  

 

Примечания

^а   Необходимо минимизировать воздействие УФ-излучения на ДНК во избежание образования тиминовых димеров, что может повлиять на молекулярное клонирование.

^б Можно не отделять большой и малый фрагменты один от другого при лигировании, а клонировать оба вместе и лишь впоследствии отбирать плазмиды со вставкой ДНК нужного размера. В приведённом простом случае будет получаться всего два типа рекомбинантных плазмид – c нужным размером 6, 8 kb и более крупных (12, 6 kb).

^в  Более высокий процент извлечения ДНК из кусочка геля даёт бохимическое разрушение агарозы ферментом агаразой, электроэлюция ДНК или использование легкоплавкой агарозы. В последнем случае гель плавят нагреванием, добавляют холодный буфер TBE, осаждают хлопья агарозы центрифугированием, а ДНК высаживают спиртом.

          

 

Работа 7.2. Лигирование ДНК вектора и гена

 

Рестрикционные фрагменты ДНК вектора и гена нужно ковалентно объединить в одну двухцепочечную кольцевую молекулу ДНК, ввести вектор с «чужеродной ДНК» (англ. foreign DNA либо transgene) в клетку E. coli и размножить полученный клон. В качестве клеток-хозяев используют и другие бактерии, а также пивные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. В отличие от E. coli в клетках этих эукариотических микроорганизмов возможен пост-трансляционный процессинг эукариотического белка («созревание»). Микробиологические манипуляции с бактериями и дрожжами схожие.    

Л

игирование («сшивание») фрагментов ДНК проводят с помощью фермента ДНК-лигазы. Для этого смешивают рестрицированную одной и той же рестриктазой ДНК плазмиды и гена, добавляют лигазный буфер, ДНК-лигазу фага Т4, АТФ и инкубируют смесь при 16º С от 2 ч для рутинного лигирования до 12 ч для лигирования с целью получения библиотек генов.

Такая «рекомбинация in vitro» даёт рекомбинантную (гибридную) ДНК.

 

ДНК-лигаза фага Т4 катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3’-OH группой и 5’-фосфатом на соседних (сближенных, «отожжённых») комплементарных «липких концах» в присутствии ATФ и ионов Mg²⁺:  

 

5’–…-G _{OH  P}A-A-T-T - C-...–3’    = 5’–…-G-A-A-T-T-C-...–3’

3’–…-C - T-T-A-A _{OH P} G-...–5’       3’–…-C-T-T-A-A-G-...–5’

                  

Некоторые рестриктазы имеют разные сайты узнавания, но дают одинаковые липкие концы. При таком лигировании полученная ДНК не будет резаться ни одной из двух использованных рестриктаз. Но гибридный сайт может резаться третьей рестриктазой. Так, фермент SauIIIА разрежет сайт, полученный при лигировании BamHI- и BglII- рестрикционных фрагментов ДНК (см. прил. 3).

Приведена стандартная процедура лигирования ДНК-рестриктов, широко используемая при создании искусственных генетических программ.

 

Материалы и оборудование

ДНК-лигаза фага Т4, ДНК фагмиды pBluescript II SK+, обработанная рестриктазой BamHI, ДНК плазмиды pSUP106:: nptI-sacB-sacR, гидролизован-ная рестриктазой BamHI или малый фрагмент плазмиды.

Растворы

- 10х буфер для Т4 ДНК-лигазы: 400мМ Tris–HCl, рН 7, 8; 100мМ MgCl₂; 100мМ ДТТ; 5мМ АТФ.

- Cреда 2 YT (тема 1)

- Канамицин. Раствор 100 мг/мл в воде.

Методика

1. Смешать рестрицированную ДНК плазмиды и гена в соотношении от 1: 2 до 1: 10. Молярное количество ДНК вставки должно превышать количество молекул ДНК вектора для «конкуренции» за вектор с целью повышения выхода рекомбинантов. Существует оптимум концентраций вектора и вставки. Использование слишком низких концентраций вставки вызовет преимущественное самолигирование вектора, слишком высоких – преимущественное образование конкатемеров. Общая концентрация ДНК в реакционной смеси не должна превышать 10 мкг/мл. 

2. Добавить к смеси 10´ лигазный буфер ^а – 2 мкл, ДНК-лигазу фага Т4 в количестве 1 – 2 единиц ^б, довести до 20 мкл деионизованной водой.

3. Инкубировать смесь при 16º С от 2 до 12 ч ^в.

4. Переосадить лигазную смесь спиртом.

5. Провести трансформацию клеток E.coli с отбором клонов на канамицине.

6. Отобранные клоны проанализировать на наличие рекомбинантной ДНК электрофорезом и рестрикцией (возможен скрининг и с помощью ПЦР).

Примечания  

^а ДНК-лигаза фага Т4 удовлетворительно работает во многих рестриктазных буферах после добавления 0, 5мМ АТФ. Проявляет при этом 75 – 100% активности. Т.е. после рестрикции можно сразу ставить лигазную реакцию. Подавляют рестриктазную активность в этом случае предварительным прогревом образца.

^б Для лигирования по тупым концам необходимо брать 5 ед. ДНК-лигазы. При таком лигировании дополнительно в лигазную смесь добавляют 2 мкл 50% ПЭГ – 4000 или 1 мкл 100мМ спермидина для вязкости, уменьшения флуктуаций слоев жидкости.

^в В новых векторах серии TOPO^TM ТА Cloning® Kit (Invitrogen^TM, Life Technologies) для лигирования ДНК применяют ДНК-топоизомеразу I. Эти векторы очень удобны для клонирования ПЦР-продуктов, которые не нужно при этом подвергать предварительной рестрикции, либо наращивать концы из PolyА. Время лигирования составляет 5 – 10 мин.

 

 

Работа 7.3. Рестрикционное картирование вставки ДНК в плазмиде

Лигирование рестрикционных фрагментов ДНК – это во многом случайный процесс. В идеале один фрагмент ДНК вектора и один фрагмент ДНК вставки должны соединиться друг с другом и замкнуться в кольцо.  На самом деле среди продуктов лигирования встречаются самые разнообразные сочетания с различным количеством фрагментов в разных ориентациях. Другое дело, что не все они затем селектируются при трансформации. Отбор рекомбинантных клонов в приведённом примере можно вести как по маркеру вектора (Ap^r), так и по маркеру вставки (Km^r), что значительно удобнее.

 

При отборе по маркеру ампициллин-устойчивости вектора будут селектированы клоны E. coli с исходным «пустым» вектором и с вектором, содержащим вставку, возможно, не одинарную или делетированную. Причём в обеих возможных ориентациях (только одна ориентация бывает при клонировании по сайтам двух разных рестриктаз). Проверить наличие вставки ДНК в вектор и её ориентацию можно рестрикцией. Нужно заметить что в приведённом конкретном случае для выбраковки клонов без вставки можно использовать и так называемую «сине-белую селекцию», основанную на использовании гена b-галактозидазы LacZ вектора pBluescript II (прил. 6, 15).

 

При отборе по маркеру канамицин-устойчивости вставки клетки с исходным вектором элимируются, что упрощает анализ трансформантов. Ориентация вставки в приведенном примере тоже не важна, так как ген sacB в конструкте находится под собственным промотором с регуляторной областью sacR и будет экспрессироваться, находясь на любой их двух цепей ДНК (в других случаях важно попасть в рамку чтения! ). Кроме того, ген sacB придаёт грамм-отрицательным бактериям чувствительность к сахарозе, т.е. отобран-ные клоны не должны расти на 2YT-агаре, содержащем 5% сахарозы.

 

Материалы и оборудование

Рестриктаза BamHI, рестриктаза EcoRI, плазмидная ДНК из клонов- трансформантов.

Растворы

-Cреда 2YT(тема 1).

-10´ буфер для рестриктазы BamH1(тема 5).

-Канамицин, раствор 100 мг/мл.

Методика

1. После проведения процедуры трансформации компетентных клеток E.coli лигазной смесью посеять клетки шпателем на свежую агаризованную среду 2YT c антибиотиком канамицином (100 мкг/мл).

2. Отсеять 20 выросших на следующий день колоний на эту же среду.

3. Нарастить отдельные клоны в 5 мл жидкой среды 2YT c антибиотиком.

4. Выделить плазмидную ДНК из отдельных клонов процедурой минипреп.

5. Провести электрофорез плазмидной ДНК, отбраковать аномальные клоны.

6. ДНК из 10 клонов гидролизовать рестриктазой BamHI (вырезать вставку).

7. Провести электрофорез резаной ДНК с маркерами молекулярного веса для контроля размера вставки ДНК (3, 8 kb). Клоны с аномальными вставками «чужеродной ДНК» следует выбросить.

8. Определить ориентацию вставки с помощью второй рестриктазы ^а. Для этого гидролизовать ДНК плазмид рестриктазой EcoRI, имеющей сайт узнавания внутри кассеты ближе к гену nptI, чем к sacR. Среди разных плазмид одного размера должно получиться два типа картин рестрикции.

9. Заложить рекомбинантные клоны E.coli с обеими ориентациями вставки ДНК в векторе pBluescript II на хранение.

Примечание

^а  Чтобы вставка ДНК в вектор происходила только в одной ориентации нужно использовать для рестрикции два разных фермента.

 

 

Тема 8. ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИЙ

Трансформацию бактерий очищенной ДНК впервые осуществили Мандел и Хига (Mandel, Higa, 1970). При инкубации ДНК фага лямбда λ с клетками E. coli в растворе CaCl₂ при температуре 0°С произошло проникновение ДНК фага внутрь бактериальных клеток, что в дальнейшем привело к размножению фаговых частиц и лизису клеток бактериальной культуры. То есть произошло то же самое, что и при инфекции природным фагом. Однако в норме «голую» ДНК бактериальные клетки поглощать не способны (кроме гемофильных и ряда грам-положительных).

 

Последующее развитие метода шло эмпирическим путем. Современная процедура включает получение так называемых «компетентных» клеток E. coli, способных воспринимать чужеродную ДНК, «тепловой шок», при котором ДНК проникает внутрь клетки, и отбор трансформированных клеток путём выращивания бактериальной культуры в селективных условиях.

 

Плазмиды при проведении трансформации E. coli попадают только в очень небольшую часть (0, 01 – 5%) клеток. Для отбора трансформированных клеток, несущих рекомбинантную ДНК, используют селективные маркеры, например, гены устойчивости к антибиотику. Многие векторы содержат ген устойчивости к ампициллину bla. Он кодирует фермент β -лактамазу, который разрушает лактамное кольцо ампициллина (прил. 3, 4). После осуществления процедуры трансформации бактерии высеивают на питательный агар, содержащий ампициллин. При этом выживают и образуют колонии только те клетки, в которые попала плазмида и синтезируется активная β -лактамаза. Эти клоны E. coli называют трансформантами. Другие векторы несут гены устойчивости к канамицину, тетрациклину (см. прил. 1).

 

Таким образом, получившие рекомбинантную плазмиду, т.е. трансформированные или изменённые по сравнению с исходными клетки приобретают способность размножаться на питательных средах, содержащих антибиотики. В то время как на остальные клетки бактериальной культуры антибиотики оказывают бактериостатическое или бактерицидное действие.

 

Разработанные позднее методы электротрансформации клеток обладают более высокой эффективностью по сравнению с «химической» или Ca²⁺-трансформацией. Эти методы требуют специального оборудования для «электропробоя» мембран клеток – электропораторов (работы 8.3–8.4).

 

 

Работа 8.1. Приготовление компетентных клеток E. coli

Приведённая процедура предполагает получение компетентных клеток E. coli путём их инкубации при низкой температуре в растворе, содержащем катионы Ca²⁺ (Inoue, Nojima, Okayama, 1996). Чтобы повысить уровень трансформации помимо CaCl₂ в раствор добавляют различные вещества.

 

Приобретшие компетентность «кальциевые клетки» следует использовать сразу (работа 8.2). Если по каким-то причинам это сделать невозможно, то 1–2 дня максимум они могут храниться в холодильнике при +4°С, пока полностью не утратят компетентность. Поэтому их лучше быстро заморозить в жидком азоте и хранить при –70°С. Все работы с компетентными клетками проводят на холоде, используя поддоны с мелкоколотым льдом или снегом.

Материалы и оборудование

Штамм E.coli XL1–Blue, диметилсульфоксид (ДМСО).

Растворы

- Среда SOB.2% триптон; 0, 5% дрожжевой экстракт; 10мМ NaCl;             2, 5мМ KCl; 10мм MgCl₂; 10мМ MgSO₄.

- Буфер TB.10мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N’-2-этансульфо-новая кислота, можно исп. PIPES или BES); 15мМ CaCl₂; 55мМ MnCl₂;  250мМ KCl.

 

Методика

1. Рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной агаризованной средой SOB, выращивать при 37°С в течение ночи.

2. Несколько колоний E. coli (10 – 12) диаметром приблизительно 2 – 3 мм поместить в 40 мл среды SOB в колбе на 0, 5 – 1 л. Растить при интенсивном встряхивании на качалке при скорости вращения 200 – 300 об/мин до оптической плотности OD₆₀₀ = 0, 6 при температуре 37°С ^а. Обычно на это требуется 2 – 2, 5 ч. Все дальнейшие манипуляции проводить на льду.

3. В 50 мл центрифужную пробирку поместить 30 мл культуры клеток, оставить при 0°C на 10 – 15 мин.

4. Центрифугировать 10 мин, 3000 об/мин, +4°C. Слить супернатант.

5. Центрифугировать 20 с, 3000 об/мин, +4°C. Удалить жидкость пипеткой.

6. Суспензировать в 10 мл буфера TB, оставить при 0°С на 10 – 15 мин.

7. Повторить п. 4 и п. 5.

8. Ресуспензировать осадок клеток в 2 мл буфера TB.

9. Добавить криопротектор ДМСО до 3, 5% (70 мкл), оставить при 0°С на 10 – 15 мин.

10. Повторить п. 4. Ресуспензировать клетки в остатках жидкости.

11. Разлить по 100 мкл в охлаждённые 1, 7 мл пробирки. Использовать «кальциевые клетки» сразу или заморозить в жидком азоте.

 

Примечание

^а При выращивании бактерий при температуре 37°С получается компетентность среднего уровня. При росте культуры E. coli при 18°С компетентность клеток получается выше, но время роста до нужной плотности удлиняется до нескольких суток.

 

Работа 8.2. Трансформация E.coli

 

Для трансформации E.coli используют компетентные клетки и очищенную плазмидную ДНК или «лигазную смесь». ДНК добавляют к клеткам и выдерживают на льду некоторое время для сорбции ДНК на клеточной поверхности. Затем проводят кратковременный «тепловой шок» при 42°С, при котором ДНК проникает внутрь клеток E.coli из-за резкого повышения текучести мембран и локальных инверсий, добавляют питательный бульон и рассеивают бактерии на агаризованной питательной среде, содержащей антибиотик. В результате экспрессии плазмидных генов антибиотико-устойчивости трансформированные клетки приобретают способность расти на средах с антибиотиками. На плотной питательной среде вырастают за 1–2 суток хорошо видимые колонии (≈ 10⁴–10⁵ клеток), но только из тех клеток, которые получили плазмиду. Т.е. клоны-трансформанты.

 

Не все трансформанты являются рекомбинантами, т.е. могут быть трансформированы исходным («пустым») вектором, если не применялись специальные процедуры для предотвращения такой возможности. Биологи-молекулярщики, к примеру, используют для рестрикционного гидролиза ДНК два разных фермента или обрабатывают ДНК вектора щелочной фосфатазой, чтобы вектор не мог лигироваться «сам на себя». Можно отличить колонии клонов-рекомбинантов и уже после высева клеток на питательный агар процедурой так называемой «сине-белой селекции» (см. прил. 5, 6, 14).

Приведенная далее процедура трансформации является стандартной. До появления электропораторов широко применялась в практике молекулярно-био(техно)логических исследований и используется до настоящего времени.

Материалы и оборудование

Компетентные «кальциевые клетки» кишечной палочки E.coli XL1–Blue, раствор плазмидной ДНК pBR322 (0, 5 мкг/мл), микротермостат.

Растворы

- Среда SOС.На 100 мл: в среду SOB (работа 8.1) внести 5 мл 20% глюкозы.

- 0, 5M β -меркаптоэтанол.

Методика

1. Приготовить раствор плазмидной ДНК pBR322 с концентрацией 5 нг/мл. Для этого из концентрированного 100´ стокового раствора (0, 5 мкг/мл) взять 1 мкл и добавить к 100 мкл деионизованной воды.     

2. Оттаять во льду 0, 5M β -меркаптоэтанол (антиоксидант, восстановитель дисульфидных связей) и аликвоту «кальциевых клеток».

3. К аликвоте 100 мкл компетентных клеток добавить 4 мкл 0, 5M β -меркап-тоэтанола и 10–50 пг (2–10 мкл) приготовленного раствора ДНК pBR322.   

4. Оставить пробирку при 0°C на 20–30 мин без встряхивания для осаждения ДНК на поверхности клеток.

5. Провести тепловой шок при 42°C в течение 30 с ^а на водяной бане или в микротермостате. После этого сразу поместить пробирку в лёд на 1–2 мин.  

6. Добавить 400 мкл среды SOC и встряхивать на шейкере при 37^oС полчаса.                        

7. Высеять аликвоту 50 мкл из суспензии клеток на чашку с агаром 2YT, содержащим 100 мкг/мл ампициллина ^б.

8. Оценить на следующий день эффективность трансформации. Если на чашке Петри выросло N колоний, то эффективность трансформации равна N´ 10⁶ колоний на 1 мкг ДНК ^в.

Примечания  

^а    Ряд протоколов рекомендуют более продолжительный тепловой шок (до 3 мин).

^б Посев на агаризованные среды производится следующим образом. Простерилизовать в пламени спиртовки стеклянный шпатель. Охладить его. Поместить аликвоту суспензии клеток на поверхность подсушенного питательного агара. Растереть суспензию шпателем по поверхности агара до полного исчезновения остатков жидкости.

^в  Если требуется получить как можно больше колоний на 2YT-агаре, например при создании библиотеки, то нужно высеять на чашку Петри 10–50 мкл суспензии для определения титра, а оставшиеся клетки хранить в течение ночи при 0°С. Титр при этом не изменяется. На следующий день рассчитать количество клеток на высев и посеять бактерии шпателем на селективный агар. Максимальная эффективность трансформации может составлять 10⁷–10⁸ клеток-трансформантов на 1 мкг ДНК плазмиды.

Top of Form 1

Bottom of Form 1

 

 

Работа 8.3. Подготовка электрокомпетентных клеток E. coli

 

Электропорация – эффективный физический метод введения ДНК в бактериальные клетки, а также в культивируемые клетки растений (протопласты), грибов, животных и человека. Основатель метода – Эберхард Нейман (Neuman, 1982). Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать значения 80% от числа выживших клеток бактерий. Для обычной «химической» трансформации эта цифра не достижима, она может доходить до 10⁹–10¹⁰ на 1 мкг ДНК. Появление метода электропорации клеток способствует интенсивному продвижению технологий биоинженерии, являющихся частью приоритетного направления развития науки и техники РФ «Технологии живых систем».

 

Метод основан на том, что под действием краткосрочного (около 5 мс) импульса с напряжением около 2, 5 кВ в мембране клетки E. coli образуются кратковременные поры через которые ДНК проникает внутрь клетки.

 

Процедура очень эффективная, однако для неё требуется очень чистый обессоленный препарат ДНК. При работе с неочищенными препаратами либо проскакивает искра, либо компетентность резко падает, становясь низкой.

Для подготовки «электрокомпетентных клеток» их несколько раз отмывают в растворе криопротектора (глицерин) на холоде и быстро замораживают в жидком азоте, либо используют сразу. 

Материалы и оборудование

Штамм кишечной палочки E.coli XL1–Blue, глицерин.

 

Растворы

-Среда YENB. 0, 75% дрожжевой экстракт (Бакто); 0, 8% Nutrient Broth, pH 7, 5. Эту среду можно заменить средой 2YT или LB без существенного ухудшения результатов трансформации.

-10% глицерин.

 

Методика

1. Снять петлёй с чашки с соответствующим селективным антибиотиком несколько (5–20) колоний бактерий, поместить в 500 мл предварительно прогретой до 37°С жидкой среды YENB, находящейся в 2 л колбе.

2. Растить культуру в течение приблизительно 8 ч на качалке при 200–300 об/мин при 37°С до достижения оптической плотности OD₆₀₀=0, 7 (годится диапазон 0, 5–1, 0). Культуру охладить в течение 5 мин во льду при 0°С. Все дальнейшие манипуляции проводить на холоде, во льду или холодильнике при +4°С. Необходимо заранее охладить деионизованную воду и глицерин.

3. Центрифугировать при 4500 об/мин 10 мин при +4°С, затем слить культуральную жидкость, дополнительно центрифугировать 5 с при 3000 об/мин и отобрать остатки питательной среды микропипеткой.

4. Два раза промыть клетки в 100 мл холодного 10% глицерина. Сначала ресуспензировать клетки с помощью микропипетки и вортекса. Затем центрифугировать 7–10 мин при 4500 об/мин при +4°С. Слить жидкость. Дополнительно центрифугировать 5 с при 3000 об/мин и отобрать остатки.

5. Промыть клетки в 20 мл 10%-ного глицерина, аналогично п. 4.

6. Добавить к осадку 10% глицерин в объёме, равном объёму клеток (должно получиться прибл. 0, 7–2, 0 мл суспензии), ресуспензировать.

7. Разлить по аликвотам полученные компетентные клетки. Одна aликвота на электропорацию составляет 50 мкл, поэтому объём должен быть кратен 50. Использовать сразу или заморозить в жидком азоте. Замороженные клетки можно продолжительное время хранить при –70^oС.

 

Работа 8.4. Электропорация E. coli

 

В специальную кювету с зазором между электродами 1–2 мм добавляют «электрокомпетентные клетки» и очищенную плазмидную ДНК, пропускают высоковольтный импульс и сразу же добавляют к клеткам порцию жидкой питальной среды. Затем клетки рассеивают шпателем на питательный агар с антибиотиком и инкубируют сутки до появления хорошо видимых колоний.

 

Компетентные Ca²⁺-клетки E.coli можно трансформировать неочищенной лигазной смесью и вообще любой ДНК, находящейся в умеренно-солевом буфере. В случае электрокомпетентных клеток ДНК должна быть очищена, поскольку высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке электропоратора.

 

Напряжённость электрического поля, продолжительность его действия, концентрация ДНК и плотность суспензии реципиентных клеток для каждой клеточной культуры, отличной от E.coli, подбирают экспериментально, с тем, чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК клетками и их выживания после «электропробоя» биомембран.

Поскольку электропоратор является высокоспециальным прибором, то к нему прилагаются детальные инструкции по проведению трансформации клеток разного типа (производители Bio - Rad, Eppendorf).

 

Материалы и оборудование

Электропоратор, кюветы для электропоратора (с зазором 2 мм), «электрокомпетентные клетки» E.coli XL1–Blue, раствор ДНК фагмиды pBluescript II SK+ (0, 5 мкг/мл) или лигазная смесь.

Методика

1. Кювету заранее охладить во льду или в холодильнике в течение 5–10 мин.

2. Оттаять необходимое количество клеток во льду. Встряхнуть.

3. Перенести аликвоту ДНК ^а в количестве 10 пг (2 мкл раствора 0, 5 мкг/мл, разведённого в 100 раз) в пробирку и затем добавить 50 мкл компетентных клеток. Можно, наоборот, к клеткам прибавить ДНК и осторожно смешать.

4. Смешать наконечником, не пипетировать.

5. Перенести кювету в ячейку электропоратора.

6. Установить параметры электропорации: 2, 5 кВ при зазоре кюветы 2 мм.

7. Провести импульс, нажав соответствующую кнопку. Обычно получается время импульса порядка 5 мс, значение обязательно нужно проверить.

8. Добавить в кювету 1 мл среды SOC (работа 8.2) и пипетировать 2–3 раза.

9. Перенести электропорированные клетки в пробирку, инкубировать в течение 0, 5–1 ч при 37°C ^б с аэрацией при качании на шейкере.

10. Высеять аликвоту 50–100 мкл на 2YT-агар с нужным антибиотиком.

Примечания

^а От солей в препарате ДНК можно избавиться микродиализом. Или переосадить ДНК и хорошо промыть осадок. Самый простой способ защититься от попадания лигазы в клетки при трансформации лигазной смесью – инактивировать её нагревом.

^б  Это время необходимо для возобновления биохимических процессов в клетке и начала транскрипции генов устойчивости к антибиотикам и сопряжённой трансляции.

 

Тема 9. ВЫДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА

Гены клонируют либо с собственными регуляторными элементами (промоторами, терминаторами и др.) в векторах для клонирования, либо структурную часть гена подстраивают генно-инженерными методами под какой-либо регулируемый промотор в векторах для экспрессии. В этом случае экспрессию гена сравнительно легко регулировать. В норме он, как правило, репрессирован. Наработка рекомбинантного белка начинается лишь после добавления определённого индуктора в питательную среду для культивирования клеток-продуцентов. Очень часто в векторах для экспрессии используют промотор LacZ гена b-галактозидазы E.coli (см. прил. 6). Индуктором экспрессии белка с этого промотора является лактоза или негидролизуемый аналог лактозы – изопропил-b-D-тиогалактозид (ИПТГ). Добавление глюкозы в среду репрессирует биосинтез белка.

 

Некоторые векторные системы, использующие для транскрипции клонированного гена не аппарат клетки-хозяина, а весьма процессивные РНК-полимеразы бактериофагов, также индуцируются с помощью ИПТГ. Так, в штамме E.coli BL21(DE3) индуцируемый ген РНК-полимеразы фага Т7 (рекомбинантный, с промотором L ac Z -типа) находится в хромосоме клетки-хозяина, а целевой ген под промотором фага Т7 находится на какой-либо плазмиде серии pET (Novagene^TM, прил. 1, 2). В таких системах полностью отсутствует «фоновая» экспрессия, поскольку транскрипция и сопряжённая с ней трансляция клонированного гена возможны только после индуцированного синтеза фаговой РНК-полимеразы. Клонирование гена в плазмиды pET30a, pET30b и pET30c обеспечит гарантированное попадание вставки ДНК в нужную рамку чтения, поскольку эти плазмиды отличаются инсерцией 0, 1 или 2 нуклеотидов за промотором фага Т7.

 

В работах 9.1–9.3 приведены протоколы методов для индуцирования синтеза рекомбинантного белка в клетках E. coli c промотора LacZ, выделения белка из периплазмы бактериальных клеток и его очистки диализом.

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: