Нативный препарат плазмидной ДНК pBluescript II.

Формы плазмиды:

л – линейная (с разрывом в обеих цепях ДНК); с – суперспиральная кольцевая; ок – открытая кольцевая (с разрывом в одной цепи ДНК); мм – димерная и мультимерные; хром – остатки хромосомной ДНК; sacB – кассета nptI-sacB-sacR.

Приложение 13. Электрофореграмма продуктов рестрикции ДНК фага лямбда   и геномной ДНК E. coli

 

 

Обозначения дорожек:

 

1. – нативная ДНК фага λ размером 48502 п.н.;

2. – ДНК фага λ, гидролизованная рестриктазой HindIII;

3. – тотальная ДНК E. coli, гидролизованная рестриктазой HindIII (неполный гидролиз)

      

Примечание.При гель-электрофорезе сравнивают электрофоретическую подвижность фрагментов ДНК или нативных молекул ДНК, находящихся в одной конформации: линейную форму сравнивают с линейной, суперспиральную – с суперспиральной, одноцепочечную – с одноцепочечной и т.д. Здесь нативная ДНК фага лямбда тоже линейная, хотя его репликативная форма в клетках E. coli замкнута в кольцо благодаря cos-сайтам.

 

Наиболее крупные фрагменты ДНК размером 23, 1kb  и 48, 5kb эффективно не разделяются, поскольку использован 1, 5% агарозный гель (см. тему 3). Низкомолекулярные фрагменты окрашиваются слабее, так как связывают меньше бромистого этидия EtBr, уходящего из ДНК при форезе к катоду. Здесь фрагмент размером 564 н.п. дорисован, поскольку был малозаметен, хотя молярные концентрации всех рестрикционных фрагментов одинаковы. При повышении общей концентрации ДНК верхние фрагменты постепенно сольются в одно яркое пятно.

 

Приложение 14. Схема клонирования ДНК

Примечание.В приведённой схеме кроме скрининга плазмид по размеру возможна «сине-белая селекция» рекомбинантной ДНК. При клонировании под промотор фага Т3 (P_T3) нарушается целостность гена LacZ и фермент                     b-галактозидаза в клетках не синтезируется. После высева клеток бактериальной культуры, трансформированной продуктами лигазной реакции на питательный агар с ампициллином, хромогенным субстратом X-gal и индуктором ИПТГ вырастают бактериальные колонии двух типов. Колонии с голубой окраской будут содержать «пустой» вектор, а обычные «белые» колонии – рекомбинантную ДНК. В каждой колонии ≈ 10⁴–10⁵ клеток.

 

Гибридные молекулы ДНК называют рекомбинантными молекулами, потому что объединение клонируемой и векторной ДНК является не чем иным, как рекомбинацией in vitro.

 

Приложение 15. Общая схема ПЦР

 

(первый цикл)

Примечание.Приведён только первый цикл ПЦР. Первая одноцепочечная молекула ДНК строго определённого размера, от 5’-концевого нуклеотида одного праймера до нуклеотида, комплементарного 5’-концевому нуклеотиду другого праймера, появляется только после второго цикла. Первая двухцепочечная молекула ДНК такого размера – после третьего цикла. Затем ПЦР-продукт, или ампликон, с определённым числом пар нуклеотидов начинает накапливаться в последующих циклах. Ампликон имеет фиксированный размер, поскольку матрица теперь ограничена, её дальнейшее сканирование ДНК-полимеразой невозможно и матричный синтез биополимера обрывается.

 

В результате этой ферментативной реакции из единичных молекул ДНК-мишени синтезируется de novo в микрограммовых количествах и в миллионах копий определённая ДНК, или амплификат. Другими словами, происходит селективная амплификация ДНК in vitro (англ. amplify – увеличивать, расширять). In vivo миллион копий ДНК получается за миллион митозов.

 

Теоретический предел обнаружения ДНК с помощью метода ПЦР ( одна молекула) и практический минимум фактически совпадают, либо находятся близко один от другого. Для сравнения: иммуноферментный анализ на присутствие патогенного микроба требует биоматериала, по меньшей мере, из сотни клеток.

 

 

 

Приложение 16. Сравнение аминокислотных последовательностей

НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского и гадюки обыкновенной

 

 

> > > QUERY, 256 aa vs TMP.q2 library

> > QUERY                                                                  (335 aa)

 

97.7% identity (99.6% similar) in 256 aa overlap (1-256: 24-279)

 

 

Entrez Lookup Re-search database General re-search

 

                                 10   20   30   40   50 

QUERY1                        WLMAWTCLEINTLSMIPVISKTNHPRATEATTKYFLTQTLASITILSMTTLNALNTS

                        :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::

QUERY2 PMSWITITISIFMTTTLITMTTHWLMAWTCLEINTLSMIPVISKTNHPRATEATTKYFLTQTLASITILSMTTLNALNTS

          10   20   30   40   50   60   70   80

   60   70   80   90  100  110  120  130 

⇐ Предыдущая234567891011Следующая ⇒

Поделиться: