Тема 5. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ И ФАГОВОЙ ДНК

 

Плазмида – внехромосомный самовоспроизводящийся генетический элемент (фактор наследственности) бактерий и некоторых других организмов, в частности дрожжей. Все векторы для клонирования ДНК получены на основе плазмид либо вирусов. Векторы составляют основу как генетической, так и белковой инженерии. Кроме того, рекомбинантную ДНК, т.е. ДНК вектора, объединённую с нужной исследователю ДНК, применяют в клеточной инженерии, инженерной энзимологии, генной терапии и др.

 

Плазмида представляет собой кольцевую (очень редко – линейную) двухцепочечную молекулу ДНК, способную к автономной репликации в клетке организма-хозяина. Векторная плазмида – переносчик ДНК.

 

Среди методов выделения плазмидной ДНК наиболее распространены разновидности метода щелочного лизиса клеток бактерий, разработанного Бирнбоймом и Доли в 1979 году (Birnboim, Doly, 1979). Они позволяют легко отделить плазмидную ДНК от высокомолекулярной хромосомной ДНК. Пептидогликан (муреин) клеточной стенки разрушают лизоцимом, а мембрану клетки-хозяина растворяют детергентом SDS в щелочных условиях при значении рН около 12, 5. Хромосомная ДНК при этом фрагментируется и денатурирует необратимо. Плазмидная ДНК также денатурирует, но не фрагментируется ввиду её небольшого размера и обе цепи ДНК остаются сцепленными. При понижении рН после добавления раствора ацетата калия с рН 5, 0, обе цепи плазмиды ренатурируют друг с другом. Одноцепочечные фрагменты хромосомы из разных клеток ренатурируют (регибридизуются) случайным образом и образуют высокомолекулярный творожистый осадок.

 

Этот осадок легко отделяется центрифугированием от оставшейся в растворе плазмиды, которую затем осаждают этанолом. Поскольку in vivo ДНК не бывает свободной от белков, то необходима депротеинизация образца.

 

Репликативная форма фагов, существующая внутри инфицированных клеток бактерий, также представляет собой молекулы двухцепочечной кольцевой ДНК и легко выделяется методом щелочного лизиса клеток.

 

 

Работа 5.1. Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК

(минипреп)

Приведённый протокол представляет собой одну из модификаций метода щелочного лизиса клеток бактерий. Это один из лучших методов для получения плазмидной ДНК высокого качества. Его достоинствами являются простота и высокая скорость, сравнимая только с выделением ДНК на микроколонках. Количества ДНК достаточно для нескольких рестрикций. При масштабных проектах используют процедуру максипреп (работа 4.2).

Плазмида pBR322, препарат ДНК которой предполагается получить, – один из первых векторов молекулярного клонирования (Bolivar et al., 1977).

Материалы и оборудование

Штамм E. coli XL1–Blue (Stratagene^TM), трансформированный плазмидой pBR322 (см. прил. 1, 4), микроцентрифуга, шейкер.

 

Растворы

-Раствор Iдля выделения плазмидной ДНК: 50мМ глюкоза; 100мМ   Tris–HCl, pH 8, 0; 10мМ ЭДТА. Хранить при +4°С, перед использованием добавить лизоцим до 5 мг/мл.

-Раствор II^а.0, 2N NaOH; 1% SDS. Готовить свежий раствор перед использованием, допускается лишь непродолжительное хранение при комнатной температуре в плотно закрытой пластиковой посуде.

-Раствор III.3М ацетат калия, рН 5, 0. На 100 мл: 5M ацетат калия – 60 мл; CH₃COOH ледяная – 11, 5 мл; H₂O – 28, 5 мл.

-Смесь фенол–хлороформ   (работа 1.1)

-Смесь хлороформ–изоамиловый спирт(работа 1.1).

-Ампициллин.Раствор 100 мг/мл в воде. 

Методика

1. Вырастить культуру клеток E.coli с плазмидой pBR322 в 5 мл питательной среды 2YT (тема 1), содержащей 100 мкг/мл антибиотика ампициллина, в течение 16–24 ч на термостатируемой роторной качалке-шейкере при температуре 37°С и скорости 200–300 об/мин.

2. Осадить клетки из культуральной среды. Для этого поместить 1, 5 мл «ночной культуры» E.coli в 1, 7 мл микроцентрифужную пробирку и центрифугировать в течение 2 мин при 10000 об/мин. Удалить супернатант выливанием через край. Повторить осаждение в эту пробирку ещё 2 раза.

3. Центрифугировать 10 с дополнительно, отобрать остатки культуральной среды микропипеткой.

4. Ресуспензировать осадок в 200 мкл раствора I с помощью микропипетки или вортекса. Оставить при комнатной температуре на 5 мин ^б.

5. Добавить 400 мкл раствора II, сразу же резко встряхнуть, перевернуть 5 раз. Происходит лизис бактерий и щелочная денатурация ДНК. Поместить образцы на лёд (0°С) на 5 мин ^в.

6. Добавить 300 мкл холодного раствора III, 5 раз перевернуть пробирку и оставить на льду на 5 мин ^г.

7. Центрифугировать в течение 5 мин при максимальной скорости центрифуги для осаждения хромосомной ДНК.

8. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, перенести микропипеткой в новую пробирку, содержащую 500 мкл изопропанола, смешать переворачиванием пробирки, оставить на 10 мин на столе.

9. Осадить плазмиду центрифугированием в течение 10 мин при максимальной скорости центрифуги, супернатант затем вылить через край, а остатки после короткого центрифугирования отобрать микропипеткой.

10. Плазмидный осадок растворить в 100 мкл TE-буфера (можно 200 мкл).

11. Раствор плазмидной ДНК необходимо подвергнуть дальнейшей очистке – провести фенольную депротеинизацию образца. Для этого добавить в пробирку равный объём смеси фенол–хлороформ, хорошо перемешать и разделить фазы центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин).

12. Перенести верхнюю водную фазу в новую пробирку, добавить равный объём смеси хлороформ–изоамиловый спирт (помимо денатурации протеинов она удаляет остатки фенола), хорошо перемешать и разделить органическую и водную фазы центрифугированием в течение 3 мин.

13. Отобрать верхнюю водную фазу, добавить 1/10 объёма холодного раствора 3М ацетата калия, pH 5, 0 и высадить ДНК этанолом. Для этого добавить в пробирку 1 мл холодного (–20°С) этанола и поместить образец на лёд или в морозильник не менее чем на 15 мин. На этой стадии можно прерваться: под спиртом очищенная ДНК, в принципе, может храниться годами. Но все три формы плазмиды, судя по опыту, перейдут в линейную форму.

14. Осадить плазмидную ДНК центрифугированием (10 мин, 10000 об/мин).

15. Добавить к осадку 1 мл 70% этанола для промывки осадка ДНК и центрифугировать 3 мин.

16. Слить супернатант, перевернуть пробирки на фильтр и подсушить осадок на воздухе в течение 0, 5 ч. Растворить в 50–100 мкл воды. На электрофорез следует взять 5–10 мкл образца.

17. Провести при необходимости обработку образца рибонуклеазой для удаления РНК. Следует добавить к полученному препарату плазмиды 1/100 объёма раствора РНКазы А (10 мг/мл в 10 мМ Tris–HCl (рН 7, 4), 15 мМ NaCl) и выдержать 0, 5–1 ч при 37°С. РНКазу затем можно удалить с помощью фенола, если нужно. На ДНК этот фермент влияния не оказывает. 

Примечания

^а Раствор II должен быть свежеприготовленным. Хранить его можно лишь ограниченное время, сроком до нескольких недель. Важно, чтобы в процессе хранения CO₂ из воздуха не нейтрализовал NaOH. Ёмкость должна быть с плотно завинчивающейся крышкой, лучше пластиковой, поскольку щёлочи растворяют стекло.

^б  Это время необходимо для работы лизоцима, ослабляющего пептидогликановый слой. Если фермент не добавлен (клетки кишечной палочки удовлетворительно лизируются и без лизоцима), можно сразу переходить к следующему пункту.

^в Превышение времени денатурации чревато тем, что плазмида денатурирует необратимо – одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурированные плазмиды вполне годятся для сиквенса, но они не режутся рестриктазами и обладают аномальной подвижностью.

^г Происходит нейтрализация щелочной среды. Хромосомная ДНК регибридизуется случайным образом, образуя большие сети, кольцевая же плазмидная ДНК благополучно ренатурирует «сама на себя». Важно, чтобы нейтрализация была полной, не оставалось областей с вязким раствором. Нужно смешивать раствор вначале мягко, чтобы не фрагментировать геномную ДНК, но после того как она уже ассоциирует (приблизительно через 1 мин) надо встряхнуть посильнее. Растворы I, II, III для достижения нужного результирующего значения pH используются в объёмной пропорции 1: 2: 1, 5.

 

 

Работа 5.2. Выделение плазмидной ДНК в больших объёмах (максипреп)

 

Метод предназначен для получения значительных количеств плазмидной ДНК высокого качества. Это бывает необходимо при продолжительной масштабной работе с определёнными векторами, рекомбинантными конструкциями или клонированными генами. Приведённый ниже метод также представляет собой модификацию метода шелочного лизиса бактериальных клеток. В определённом смысле процедура выделения ДНК сводится к пропорциональному увеличению количества исходного материала и объёмов реагирующих растворов.

В данной работе предполагается получить в значительных количествах ценную векторную ДНК. Фагмида pBluescript II KS+ – это вектор компании Stratagene^TM, используемый для клонирования, секвенирования и экспрессии. Кроме того, эта фагмида (от слов фаг + плазмида) в отличие от обычных плазмид способна «упаковываться» в фаговые частицы в присутствии в клетке фага-помощника, поскольку она имеет ori фага М13, а фаговые белки для сборки вирионов поставляет хелпер. Вектор pBluescript II характеризуется более высоким числом копий на клетку чем плазмида pBR322 (см. прил. 1, 5).

Материалы и оборудование

Центрифуга для больших объёмов, весы, штамм кишечной палочки E.coli XL1–Blue, содержащий фагмиду pBluescript II KS+.

Растворы

- Раствор I(работа 4.1).

- Раствор II(работа 4.1).

- 10 М ацетат аммония.Растворить770 г в 800 мл воды, довести до 1 л.

- Ампициллин(работа 4.1).

Методика

1. Вырастить ночную культуру бактерий при 37°С в 100–500 мл богатой питательной среды 2YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина в течение          20–24 ч при скорости роторной качалки-шейкера 200–300 об/мин.

2. Центрифугировать при 4000 об/мин 10–15 мин при 4°С, слить среду.

3. Центрифугировать при 4000 об/мин в течение 1 мин, отобрать микропипеткой остатки жидкости.

4. Ресуспензировать осаждённые клетки в 10 (или 5) мл раствора I.

5. Добавить 1 мл (или 0, 5) свежеприготовленного раствора I c лизоцимом. Оставить на столе на 15 мин. (Клетки E. coli лизируются и без лизоцима).

6. Добавить 20 (или 10) мл раствора II, сразу интенсивно перемешать. Оставить на льду при 0°С на 5 мин.

7. Добавить 10 (или 5) мл холодного 10М ацетата аммония ^а (добавлять микропипеткой по каплям), смешать. Оставить при 0°С на 5 мин.

8. Центрифугировать при 5000 об/мин в течение 10 мин при +4°С.

9. Супернатант отобрать микропипеткой, разделить на две центрифужные пробирки, добавить к каждой по 12, 5 мл изопропанола. Делать это нужно на весах. Оставить на столе на 10 мин для высаживания ДНК.

10. Центрифугировать при 5000 об/мин, 4°С, 10 мин, отбросить супернатант.

11. Центрифугировать при комнатной температуре 3 мин, отобрать остатки жидкости. Осадок плазмидной ДНК не подсушивать!

12. Растворить осадок в каждой микроцентрифужной пробирке в 400 мкл 2M ацетата аммония, объединить в одной 1, 7 мл пробирке. Оставить при комнатной температуре на 5 мин (осаждение полисахаридов, белков).

13. Центрифугировать при комнатной температуре 10 мин.

14. Супернатант перенести в пробирку с равным объёмом (800 мкл) изопропанола ^б. Оставить на столе на 10 мин.

15. Центрифугировать при комнатной температуре 5 мин.

16. Сполоснуть осадок 70% этанолом.

17. Растворить плазмидную ДНК в 0, 2–1 мл Н₂O. Для электрофореза достаточно взять 5–10 мкл раствора ^в.

Примечания

^а  Использование ацетата аммония вместо ацетата калия в качестве раствора III позволяет существенно уменьшить объёмы при центрифугировании. Кроме того, в присутствии ацетата аммония осаждаются полисахариды из раствора, а также белки (см. п.12). Это позволяет исключить из протокола работу с фенолом.

^б Использование изопропанола для высаживания ДНК из раствора позволяет уменьшить объёмы. При масштабных работах важно минимизировать расход реагентов. Обычно используют равный объём изопропанола (минимум 0, 6 V, для этанола – 2 V).

^в   Подвижность плазмидных форм для небольших плазмид приведена в прил. 9. Сначала идёт суперспиральная форма, при очень высоких концентрациях перед ней можно увидеть сверхсуперспираль. Затем движется линейная (встречается в старых препаратах или при нарушении протоколов) и потом релаксированная форма плазмиды (кольцевая двухцепочечная с разрывом в одной цепи). Это три основные формы. Выше над этими формами в концентрированных препаратах можно видеть димерную суперспиральную форму. Ещё выше по направлению к лунке иногда видны остатки хромосомной ДНК. При рестрикции все формы переводятся в одну полосу, соответствующую линейной форме (остатки хромосомы штамма-хозяина дают шлейф из фрагментов, чаще всего невидимый).

 

 

Работа 5.3. Выделение репликативной формы RF фага М13

Бактериофаги (фаги) – вирусы бактерий; размножаются внутри клеток, что вызывает обычно их лизис. С химической точки зрения представляют нуклеопротеидные комплексы: фаг состоит из белковой оболочки (капсида), покрывающей одно- или двухцепочечную молекулу ДНК, или, реже, РНК.

 

Близкородственные нитевидные фаги М13, f1, fd и др. с вирионами, содержащими одноцепочечную ДНК относятся к умеренным – они не лизируют клетки, на которых размножаются (паразитируют). Векторы на основе нитевидных фагов удобны для секвенирования, поскольку из фаговых частиц можно выделить одноцепочечную ДНК +-цепей.

 

Интерес к этим фагам обусловлен ещё и тем, что они составляют основу метода фагового дисплея – одного из основных аффинных методов белковой инженерии для изучения белок-белковых взаимодействий наряду с дрожжевыми двугибридными системами и белковыми микрочипами.

 

Клонирование генов осуществляют в двухцепочечную ДНК нитевидного фага, существующую внутри клеток инфицированной популяции бактерий как плазмида. Если при клонировании «сшить» какой-либо ген c фаговым геном III (или VIII), кодирующем белок капсида gp3 (gp8), то полученный при трансляции гибридный белок будет презентирован на поверхности зрелого вириона в виде фьюжен-конструкта (англ. fusion – слияние, сплав). Такой фаг, а равно и библиотека генов в векторе М13 называется «фаг-дисплей», поскольку это дисплей пептидов на поверхности фаговых частиц (McCafferty et al., 1990).

 

Выделение двухцепочечной кольцевой репликативной (RF) формы фага М13 из клеток E. coli может быть проведено по любому из методов, используемых при выделении плазмид. Фаг М13 инфицирует только F+ штаммы кишечной палочки, поскольку сорбируется на F-пилях.

Приведена методика заражения (трансфекции) клеток E. coli фагом М13 c последующей наработкой RF-формы для получения двухцепочечной ДНК.

Материалы и оборудование

F+ штамм кишечной палочки E. coli XL1–Blue (TG-1, JS5 или другой), фаг M13 K07 в буфере ТЕ с титром 10¹³ частиц /мл, центрифуга, шейкер.

Растворы

-Раствор I(работа 4.1)

-Раствор II(работа 4.1)

-10 М ацетат аммония.Растворить770 г в 800 мл воды и довести до 1 л.

-Канамицин.Раствор 100 мг/мл в воде.

Методика

1. Вырастить культуру клеток F+ штамма E.coli в 5 мл жидкой среды 2YT в течение ночи. Число клеток при этом может достичь 10¹⁰ клеток/мл.

2. Заразить культуру фагом в соотношении 10: 1 (на 1 бактериальную клетку должно приходиться порядка 10 фаговых частиц). Для этого необходимо в пробирку к клеткам добавить 10 мкл суспензии фаговых частиц.

3. Инкубировать без качания 1 ч при 37°С. За это время фаг М13 К07      сорбируется на F-пилях, проникнет в клетку и начнётся синтез его RF. Эффективнось трансфекции E. coli выше трансформации (тема 8).

4. Добавить в 500 мл свежей среды 2YT необходимый антибиотик ^а (500 мкл раствора канамицина с концентрацией 100 мг/мл), перелить туда заражённые фагом клетки E.coli.

5. Растить культуру с аэрацией в течение ночи при 37°С.

6. Клетки осадить центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10–15 мин. Слить супернатант с культуральной средой  в чистую колбу ^б.

7. Выделить из осаждённых клеток двухцепочечную кольцевую ДНК репликативной формы фага по протоколу минипреп (работа 4.1).

Примечания

^а  Фаг M13 K07 ( Viera, Messing, 1987) является рекомбинантным и имеет ген канамицин-устойчивости (см. прил. 1). Фаг М13 «дикого типа» растят без антибиотика.

^б В культуральной жидкости содержатся вышедшие из клеток фаговые частицы. Их легко можно выделить, как описано в работе 4.4, пропорционально увеличив при этом объёмы. Титр фаговых частиц определяют путём трансфекции клеток E.coli и последующего рассева клеток на агаризованную питательную среду с антибиотиком.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: