Работа 5.4. Выделение одноцепочечной ДНК фага М13

Вышедшие из инфицированных клеток E. coli в культуральную среду фаговые частицы (вирионы) cравнительно просто можно выделить. Сначала клетки отделяют центрифугированием, а фаговые (а также фагмидные) частицы высаживают из культуральной среды полиэтиленгликолем (PEG).

 

Линейная молекула одноцепочечной ДНК каждого вириона заключена в белковый капсид. Размер ДНК фага «дикого типа» составляет 6407 нукл. Капсид включает примерно 2700 молекул белка gp8 и по несколько молекул белков gp3, gp6, gp7 и gp9, присоединяющихся к +-цепи ДНК в процессе самосборки фаговой частицы. Размеры частиц – 895 нм в длину и 6 нм в толщину. Белки можно денатурировать и затем удалить, используя фенол или другие хаотропные агенты, разрущающие третичную структуру макромолекул, а высвободившуюся ДНК высадить из раствора этанолом.

Выход ДНК фага из культуральной среды объемом 1, 5 мл из-под инфицированной культуры E. coli достаточен для фореза и секвенирования.

 

Материалы и оборудование

 Инфицированная фагом M13 K07 культура E. coli, шейкер.

Растворы

-Раствор PEG / NaCl. Водный раствор 20% PEG–6000; 2, 5M NaCl.

-Смесь фенол–хлороформ (работа 1.1).

-Смесь хлороформ–изоамиловый спирт (работа 1.1).

Методика

1. Перенести 10 мкл инфицированных фагом клеток кишечной палочки из культуры, находящейся в логарифмической фазе роста в жидкой питательной среде, в 2, 5 мл питательной среды 2YT с антибиотиком ^а. Можно также взять одну колонию петлёй со свежей чашки с 2YT-агаром.

2. Инкубировать культуру на качалке-шейкере при скорости 200–300 об/мин и температуре 37°С в течение ночи с хорошим аэрированием.

3. Отобрать 1, 5 мл культуры и поместить в 1, 7 мл пробирку типа Eppendorf.

4. Осадить клетки центрифугированием в течение 5–10 минут.

5. Отобрать супернатант в чистую пробирку и добавить 1/10 объёма PEG/NaCl (150 мкл) для осаждения фагов. Оставить при 0º С на 15 мин.

6. Центрифугировать 5 мин на максимальной скорости микроцентрифуги.

7. Удалить супернатант микропипеткой.

8. Ресуспензировать осадок фаговых частиц в 400 мкл буфера ТE ^б.

9. Добавить равный объём смеси фенол–хлороформ, хорошо перемешать встряхиванием и центрифугировать в течение 5 мин. Происходит экстракция ДНК из ДНП-комплекса. ДНК находится в верхней водной фазе, фенол внизу, а в интерфазе – денатурированные белки.

10.  Отобрать около 300–350 мкл верхней водной фазы стараясь не захватывать интерфазу в чистую пробирку.

11.  Добавить равный объём смеси хлороформ–изоамиловый спирт, встряхнуть и центрифугировать 5 мин. Происходит разделение фаз, остатки фенола растворяются в нижней органической фазе.

12. Отобрать около 250–300 мкл водной фазы в чистую пробирку. 

13. Добавить 1 мл 96% этанола и центрифугировать 10 мин, 13000 об/мин.

14. Удалить супернатант, промыть осадок. Растворить ДНК в 10 мкл H₂O.

 

Примечания

^а  Обязательно должна присутствовать селекция против незараженных бактерий. Фаги семейства М13 в отличие от фага лямбда не лизируют заражённые ими клетки. Они реплицируются, упаковываются в вирионы и выходят из клеток, не мешая им делиться; лишь размножаются инфицированные бактерии процентов на 30–40 медленнее. Однако, метаболическая нагрузка на бактериальную клетку столь велика, что если какая-то клетка окажется незараженной, то она обгонит инфицированных в росте и размножении.

^б  На этом этапе можно прерваться, убрав препарат в холодильник. На следующий день провести очистку ДНК от компонентов белкового капсида, денатурировав протеины фенолом, разрушающим третичную структуру макромолекулы (переход – глобула-цепь).

 

 

Тема 6. РЕСТРИКЦИЯ ДНК

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) широко используются в работах по картированию геномов, клонированию генов, генотипированию и других молекулярно-генетических исследованиях в качестве «молекулярных ножниц». Рестриктазы расщепляют молекулы ДНК в определённых нуклеотидных последовательностях, называемых сайтами узнавания. Эти сайт-специфические эндонуклеазы способны делать разрывы внутри цепи ДНК в отличие от экзонуклеаз, деградирующих ДНК с концов.

 

Первые рестриктазы были выделены Смитом ( Smith, 1970; Smith, Nathans, 1973 ), само же явление рестрикции-модификации ДНК впервые было обнаружено Лурия (Luria, 1952) при изучении размножения фагов на разных штаммах бактерий.

Рестриктазы II типа узнают палиндромные последовательности нуклеотидов – последовательности, имеющие ось симметрии второго порядка. Так, сайт узнавания рестриктазы EcoRI из шести нуклеотидов –GAATTC– на комплементарной цепи ДНК в том же 5’→ 3’ направлении читается точно так же. Точка разрезания находится между G и первым A, именно там происходит разрыв фосфодиэфирной связи. Образующийся при рестрикции 5’-выступающий «липкий конец» имеет в длину 4 нуклеотида:  

 

5’–…GAATTC... –3’         5’–…G _{OH          + P} AATTC...–3’

3’–…CTTAAG... –5’ =  3’–…CTTAA_{P                  HO} G...–5’

Эти ферменты, как правило, работают в форме димера, причем каждая субъединица белка гидролизует одну цепь ДНК независимо от другой. Однако на одноцепочечной ДНК они работают значительно медленнее. В зависимости от относительного расположения разрыва на комплементарных цепях ДНК получившиеся рестрикты обладают либо 5’-выступающими (EcoRI, BamHI, HindIII), либо 3’-выступающими (PstI) липкими концами. Большинство рестриктаз дают 5’-выступающие липкие концы (см. прил. 3).

 

На активность ферментов и полноту гидролиза ДНК может влиять целый ряд факторов – температура инкубации, ионный состав буфера, метод выделения ДНК и соответственно степень её загрязнения, а также уровень метилирования ДНК и специфичность метилирования. Результаты рестрикции оценивают с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле.

 

Небольшие по размеру молекулы плазмидной или вирусной ДНК при ферментативном гидролизе с помощью какой-либо рестриктазы дают строго определённое ограниченное количество рестриктов (прил. 3, 13). Препараты геномной ДНК из-за большого количества рестрикционных сайтов и неизбежной фрагментации ДНК при её изоляции из клеток дают при электрофорезе шлейф из фрагментов ДНК или «шмер» (прил. 13).

 

Система рестрикции-модификации ДНК – это ферментативная система бактерий, состоящая из двух белков рестриктазы и метилазы, специфичных к одному и тому же сайту узнавания. Эта система разрушает  попадающую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция – защита клетки от проникновения чужеродного генетического материала, прежде всего от бактериофагов и плазмид. Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования аденина или цитозина соответствующим ферментом метилазой: метилированные сайты рестриктаза разрезать не способна.

 

Для любой ДНК с известной первичной структурой можно выяснить число и локализацию всех сайтов рестрикции с помощью специальных программ для рестрикционного картирования, к примеру, программы RestrictionMapper (http: //www.restrictionmapper.org).

 

 

Работа 5.1. Рестрикция плазмидной и фаговой ДНК

Активность и количество фермента.Каждый препарат фермента обладает определённой активностью. 1 единица активности рестриктазы полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага l за 1 ч при 37°С. Коммерческие препараты обычно имеют активность 10–20 ед/мкл и требуют разведения. Гидролиз ДНК осуществляют 2–3-кратным избытком фермента, т.е. на 1 мкг ДНК берут 2–3 единицы. Хранят рестриктазы при –20°С в 50% глицерине.

Буферы. Абсолютно необходимым кофактором для работы рестриктазы являются ионы Mg²⁺. Буферную ёмкость с нужным значением показателя pH обеспечивает Тris–HCl. b-меркаптоэтанол или дитиотрейтол стабилизирует фермент. Различают высокосолевой (100мМ NaCl), среднесолевой (50мМ NaCl) и низкосолевой (без NaCl) буферы. Фирмы-поставщики вместе с ферментом продают и необходимый буфер в концентрированном виде.                                                                                                                                                                           

Объём реакционной смеси. Удобно проводить рестрикцию в объёме 20–50 мкл, когда раствор ДНК, 10´ буфер и фермент смешивают в пробирке и доводят до конечного объёма бидистиллированной или деионизованной водой. Для ферментативных реакций всегда берут выскоочищенную воду.

Температура и время инкубации.Большинство ферментов работают при 37°С (кроме ферментов из термофильных бактерий). При комнатной температуре скорость работы существенно снижается. Более длительная, чем 1 ч инкубация бывает необходимой, если гидролиз по каким-либо причинам произошел не полностью. При неполной рестрикции на электрофореграмме видны полоски ДНК, соответствующие полоскам нерезаного контроля.

 

Материалы и оборудование

Раствор ДНК плазмиды pBR322 (1 мг/мл), раствор ДНК фага l         (1 мг/мл), рестриктаза EcoRI (10 ед/мкл), термостат, оборудование для фореза. 

 

Растворы

- 10´ буфер для рестриктазы EcoRI: 500мМ Tris–HCl, рН 7, 5; 100мМ MgCl₂; 1000мМ NaCl; 10мМ ДТТ.

- 10´ буфер для нанесения образца на гель (тема 3).

Методика

1. Перед постановкой реакции (пп. 6–12) с помощью программы рестрикционного картирования RestrictionMapper можно узнать число сайтов рестрикции EcoRI в молекуле ДНК фага l и их размер. Это нужно для того чтобы представлять, что можно будет увидеть на электрофореграмме. Нуклеотидную последовательность фага можно получить в базе данных GenBank так, как описано далее (пп. 2–5).

2. Откройте главную страницу сайта Национального центра биотехнологи-ческой информации США (National Center for Biotechnology Information, US National Library of Medicine – http: //www.ncbi.nlm.nih.gov / pubmed или http: //www.pubmed.com). Введите запрос «Enterobacteria phage lambda, complete genome». Выберите вкладку «Nucleotide» и нажите «Enter». Скопируйте полную нуклеотидную последовательность бактериофага l, состоящую из 48502 н.п. (GenBank, NC_001416.1).

3. Откройте программу RestrictionMapper (http: //www.restrictionmapper.org). Введите в специальное окно нуклеотидную последовательность фага l.

4. Выберите опцию «Selected individual Enzymes», выберите фермент «EcoRI» и нажмите «Map Sites». Видно, что сайтов рестрикции 5, причем указан номер позиции нуклеотида в точке разрезания. Фрагментов получится 6, поскольку ДНК линейная. Можно узнать размеры всех рестриктов, нажав кнопку «Virtual Digest». Запишите эти размеры.

5. Проделайте ту же работу с плазмидой pBR322, задав запрос «Сloning vector pBR322», или воспользуйтесь прил. 3, 4.

6. Приготовьте реакционную смесь объёмом 20 мкл в 1, 7 мл пластиковой пробирке: 10´ буфер – 2 мкл, раствор ДНК (1 мг/мл) – 1 мкл, вода – 16, 7 мкл.

7. Тщательно перемешайте смесь пипетированием или встряхиванием, осадите капли со стенок пробирки коротким центрифугированием.

8. Достаньте фермент из морозильника, сразу поставьте пробирку в лёд. Наберите микропипеткой нужный объём раствора белка, содержащего 3 единицы активности (0, 3 мкл). Добавьте фермент к образцу ДНК и снова быстро уберите рестриктазу в морозильник на –20°С. Перемешайте и соберите жидкость со стенок пробирки коротким центрифугированием.

9. Инкубируйте пробу 1 ч ^а при рекомендуемой температуре 37°С.

10. Остановите реакцию добавлением 1 мкл 200мМ ЭДТА или прогреванием реакционной смеси при 65°С в течение 5–10 мин ^б.

11. Добавьте к препарату резаной ДНК 1/10 объёма 10´ буфера для нанесения образца на гель, перемешайте пипетированием и внесите ДНК в лунки геля. В этом буфере полученные образцы ДНК можно некоторое время хранить в холодильнике. 

12. Проведите электрофорез ДНК при напряжении в 100 В в течение 1, 5–2 ч и оцените результаты, просмотрев гель в УФ свете ^в. Сфотографируйте гель.

Примечания  

^а  Время инкубации допускается увеличивать до 2-х и более часов для полноты гидролиза. Коммерческие препараты ферментов, как правило, не содержат примесей нуклеаз и поэтому не обладают неспецифической нуклеазной активностью. Однако при слишком длительной инкубации для некоторых рестриктаз возможно проявление star-активности или активности со звёздочкой, т.е. снижение специфичности гидролиза ДНК (для EcoRI^*– NAATTN). Это приведёт к появлению «шмера» вместо чётких полос в геле.

^б  Помимо прочего, в прогретых препаратах идёт лучшее разделение рестриктов с близким молекулярным весом, для которых иногда бывает характерно «залипание». Часто такие фрагменты ДНК начинают разделяться на две отдельные полоски только ближе к концу геля. Такое можно увидеть, к примеру, для EcoRI-фрагментов ДНК фага l размером 5804 и 5643 нуклеотидов. 

^в Число сайтов рестрикции в кольцевой ДНК точно соответствует числу получаемых рестриктов. При полном EcoRI-гидролизе плазмиды pBR322 получится один рестрикционный фрагмент. При рестрикции линейной ДНК фага l (5 сайтов) получится 6 рестрикционных фрагментов с размерами 21226, 7421, 5804, 5643, 4878, 3530 п.н. Если фрагментов в образце (паттерне) видно больше, то это всегда свидетельствует о неполном гидролизе ДНК, т.е. наличии промежуточных продуктов гидролиза («недорестрикция»).

 

 

Работа 5.2. Рестрикция геномной ДНК эукариот

Хромосомная ДНК эукариот в сравнении с плазмидной, фаговой или митохондриальной содержит очень большое количество сайтов рестрикции. Кроме того, она всегда фрагментируется случайным образом при выделении, её препараты труднее очистить от белков, полисахаридов и других веществ. Помимо этого, степень её метилирования может сильно варьироваться, что оказывает сильное влияние на работу эндонуклеаз.

 

Обычно берут 3 –5-кратный избыток фермента на 1 мкг ДНК и проводят рестрикцию в течение 2–6 ч или оставляют реакцию на ночь. 10 мкг ДНК большинства высших растений соответствует 10⁶–10⁷ геномам. Концентрацию ДНК в растворе можно определить либо путём сравнения с известным стандартом при электрофорезе в агарозном геле, либо путём измерения оптической плотности разведённой аликвоты раствора ДНК.

 

При обработке геномной ДНК рестриктазами, узнающими палиндромы из шести нуклеотидов (EcoRI, BamHI, PstI и другие распространённые рестриктазы), образуются рестрикты размером от десятков нуклеотидов до 20–30 kb. Таким образом, при полном рестрикционном гидролизе ДНК эукариот получается огромное число рестриктов, десятки и сотни тысяч. При электрофорезе подвергшаяся частичному или глубокому расщеплению геномная ДНК даёт шлейф из фрагментов разного размера. Визуализировать нужный фрагмент возможно только с помощью блот-переноса ДНК на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр и гибридизации ДНК по Саузерну с радиоактивно- или флуоресцентно-меченым зондом.

 

Так называемые «мелкощепящие» рестриктазы, узнающие палиндромы из 4 нуклеотидов (SauIIIA и др.), порежут геномную ДНК на более мелкие фрагменты и в большем количестве. Для эффективного разделения высоко- или низкомолекулярных фрагментов ДНК используют разные гели (тема 3).

Материалы и оборудование

Геномная ДНК из растений табака (кукурузы, петунии) с неизвестной концентрацией, рестриктаза BamHI, образец ДНК с известной концентрацией, спектрофотометр, термостат, обрудование для электрофореза.

 

Растворы

-10´ буфер для рестриктазы BamHI: 100мМ Tris–HCl, рН 8, 0; 50мМ           МgCl₂; 1000мМ KCl; 0, 02% Triton X–100.

-10´ буфер для нанесения образца на гель(тема 3).

 

Методика

1. Определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.

2. Оцените чистоту препарата путем измерения оптической плотности при длинах волн 260, 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения ДНК, белков и полисахаридов, соответственно. Для чистой ДНК характерны значения А₂₆₀/А₂₃₅ = 2, 2 – 2, 5 и А₂₆₀/А₂₈₀ = 1, 8 – 1, 9.

3. Гидролизуйте 1 мкг тотальной ДНК табака в 50 мкл реакционной смеси в течение 6 ч ^а, отбирая через каждый час аликвоту в 10 мкл и останавливая в ней реакцию, добавлением 1 мкл буфера для нанесения образца ^б.

4. Проведите электрофорез ДНК-рестриктов. Используйте в качестве контроля нерезаный образец ДНК. Сфотографируйте гель.

 

Примечания  

^а При длительной инкубации некоторые рестриктазы могут проявлять                   star-активность (звездную, вторичную, штриховую активность), т.е. гидролизовать сайты с одним или несколькими «неправильными» нуклеотидами. Это необходимо учитывать, если планируется осуществлять молекулярное клонирование (англ. Molecular cloning).

^б  Можно остановить (временно затормозить) биохимическую реакцию помеще-нием пробирки на лёд. В этом случае при необходимости (неполный гидролиз, «недорестрикция») её легко можно возобновить. Если же она останавливалась с помощью ЭДТА, присутствующей в буфере для нанесения образца на гель, то нужно снова добавить ионы магния в эквимолярном количестве в реакционную смесь.

 

 

Тема 7. ПЦР

 

ПЦР, полимеразная цепная реакция – это ферментативное копирование определенного фрагмента ДНК in vitro c помощью ДНК-полимеразы, т.е. селективная амплификация ДНК. Границы фрагмента задают нуклеотид-ными последовательностями праймеров, поэтому копированию подвергается только определённый ген (ДНК-мишень), а не вся ДНК как при репликации in vivo. Основоположником метода считается Кэрри Муллис (Mullis, 1985).

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: