SacI, NotI, XbaI, BamHI, SmaI, PstI, EcoRI, HindIII, SalI, XhoI, KpnI.

Универсальные праймеры для секвенирования:

M13/pUC sequencing primer ( – 20)

5’ – GTAAAACGACGGCCAGT – 3’ (перед промотором P_T7);

M13/pUC reverse sequencing primer ( – 26)

5’ – CAGGAAACAGCTATGAC – 3’ (перед промотором P_T3).

Примечание.Как +-цепь, так, в принципе, и ^– - цепь ДНК фагмиды pBluescript® IIможет быть « упакована » в белковый капсид с получением вириона (фаговой частицы) после инфицирования клетки E. coli с этой фагмидой особым фагом-помощником. Одноцепочечная ДНК из вирионов удобна для секвенирования. Можно также секвени-ровать двухцепочечную ДНК фагмиды со вставкой «чужеродной ДНК» по обеим цепям, для точности. При этом используют по отдельности тот или другой универсальный праймер.

Приложение 6. Схема устройства и использования лактозного оперона E.coli

LacI

P O

LacZ

LacY

LacA

ген- регулятор	рег. элемент	структурные гены
*Белок-* *репрессор*	Промоторно- операторная зона	B-галактозидаза		Пермеаза	Трансацетилаза
*Белок-* *репрессор*	Промоторно- операторная зона	N-конец	С-конец		Трансацетилаза

Индукция гена b-галактозидазы

Фермент b-галактозидаза расщепляет дисахарид лактозу на галактозу и глюкозу. Индуктор лактозного оперона – лактоза. Она связывается с репрессором и способствует его диссоциации с промоторно-операторной зоны, обеспечивая прохождение транскрипции. Негидролизуемый аналог лактозы ИПТГ – изопропил-b-D-тиогалактозид – также может выступать индуктором.

Сине-белая селекция при клонировании

b-галактозидаза способна расщеплять субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-b-D-галактозид) на галактозу и индольное соединение голубой окраски. Колонии бактерий на питательном агаре с X-gal и ИПТГ (по 40 мкг/мл) имеют голубую окраску. При клонировании под промотор гена lacZ происходит инактивация гена, что приводит к появлению обычных («белых») колоний. При трансформации E. coli продуктами лигазной реакции получение клеткой плазмиды со вставкой «чужеродной ДНК» приведёт к появлению обычной, а не голубой колонии.

Явление a – комплементации

Синтез активного фермента в бактериальных клетках будет происходить, если его N-концевая часть кодируется плазмидой (например pBluescriptI II или др.), а C-концевая часть – встроенным в хромосому E. coli F-фактором. В этом случае штамм-хозяин должен иметь мутацию lacI^q LacZ DM 15 (конститутивный синтез репрессора I^q и N-концевая делеция гена b-галактозидазы). Это позволяет располагать на векторе не весь ген lacZ, а только его часть.

Приложение 7. Некоторые соотношения между количеством, размером и оптической плотностью для нуклеиновых кислот

1 ОЕ₂₆₀ ДНК двухцепоч.	50 мкг
1 ОЕ₂₆₀ ДНК одноцепоч.	37 мкг
1 ОЕ₂₆₀ РНК одноцепоч.	40 мкг
1 мкг ДНК двухцепоч. (размером 1 kb)	9, 3x10¹¹молекул
1 пМ ДНК плазмиды pBR322	2, 83 мкг
1 пМ ДНК двухцепоч. (размером 1 kb)	650 нг
1 kb ДНК двухцепоч.	650 kDa
1 kb ДНК одноцепоч.	330 kDa
1 kb РНК одноцепоч.	340 kDa

Приложение 8. Стандартные обозначения полиморфных позиций нуклеотидов

Символ	Полиморфная позиция	Пояснение
R	A или G	puRine
Y	C или T	pYrimidine
M	A или C	aMino
K	G или T	Keto
S	C или G	сильное /Strong/ взаимодействие – три
W	A или T	слабое /Weak/ взаимодействие – две
H	(A, C, T) но не G	H следует за G в алфавите
B	(C, G, T) но не A	B следует за A в алфавите
V	(A, C, G) но не T(U)	V следует за T(U) в алфавите
D	(A, G, T) но не C	D следует за C в алфавите
N	(A, G, C, T)	любое основание / Nucleotide

Приложение 9. Однобуквенные обозначения аминокислот

Аланин	A	Лейцин	L
Аргинин	R	Лизин	K
Аспарагин	D	Метионин	M
Аспарагиновая кислота	N	Пролин	P
Валин	V	Серин	S
Глутамин	Q	Треонин	T
Глутаминовая кислота	E	Триптофан	W
Глицин	G	Тирозин	Y
Гистидин	H	Фенилаланин	F
Изолейцин	I	Цистеин	C

Приложение 10. Генетический код

Первое основание

Кодона

Второе основание кодона

Третье

Основание

Кодона

F (Phe) F (Phe) L (Leu) L (Leu)

S (Ser) S (Ser) S (Ser) S (Ser)

Y (Tyr) Y (Tyr) STOP STOP

C (Cys) C (Cys) STOP W (Trp)

U C A G

L (Leu) L (Leu) L (Leu) L (Leu)

P (Pro) P (Pro) P (Pro) P (Pro)

H (His) H (His) Q (Gln) Q (Gln)

R (Arg) R (Arg) R (Arg) R (Arg)

U C A G

I (Ile) I (Ile) I (Ile) M (Met)

T (Thr) T (Thr) T (Thr) T (Thr)

N (Asn) N (Asn) K (Lys) K (Lys)

S (Ser) S (Ser) R (Arg) R ( Arg)

U C A G

V (Val) V (Val) V (Val) V ( Val)

A (Ala) A (Ala) A (Ala) A (Ala)

D (Asp) D (Asp) E (Glu) E (Glu)

G (Gly) G (Gly) G (Gly) G (Gly)

U C A G

Приложение 11. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации

гена НАДН-дегидрогеназы гадюки Никольского

и гена 12 S рибосомной rРНК

Обозначения дорожек:

1. – маркер молекулярного веса 100bp DNA Ladder Plus (Fermentas). Размеры фрагментов ДНК, начиная сверху: 3000, 2000, 1500, 1200, 1034, 900, 800, 700, 600, 500 п.н.;

2 – 5. – ПЦР-продукт гена 12S pРНК размером 727 п.н.;.

6-7. – ПЦР-продукт гена НАДН-дегидрогеназы размером 911 п.н.

Приложение 12. Движение различных форм плазмидной ДНК

при гель-электрофорезе

1	2	3	4	5
					хром
					мм
					ок
					–sacB

					л

					с

					→ тРНК

Обозначения дорожек:

1. – плазмидная ДНК pBluescript II, рестрицированная ферментом Eco31I;

2.– рестрицированная BamHI;

3. – с кассетой nptI-sacB-sacR, рестрицированная BamHI;

4. – рестрицированная PstI;

⇐ Предыдущая 2 3 4 5 6 7 8910 11 Следующая ⇒