Работа 9.1. Индуцированная экспрессия клонированных генов

Для получения целевого белка клетки клонов-продуцентов размножают, помещая их в свежую питательную среду. Среда должна содержать селективный антибиотик, иначе бактерии могут потерять рекомбинантную плазмиду. Наработка рекомбинантного белка начинается лишь после добавления индуктора. По мере роста бактериальной культуры возрастает суммарное количество целевого белка за счёт активной транскрипции- трансляции клонированного гена и увеличения числа клеток в популяции. Оно достигает насыщения в позднелогарифмической фазе роста культуры.

Приведена методика индукции синтеза миниантител определённой специфичности клетками клона-суперпродуцента. Миниантитела scFv – это рекомбинантные белки, состоящие из ковалентно сшитых вариабельных доменов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов (scFv – single chain Fragments variable). Клон-суперпродуцент – это клон штамма E.coli JS5, содержащий рекомбинантную фагмиду pHEN1 с геном миниантитела, специфичного к белку вирулентности VirE2 почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens (Великов с соавт., Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2006, №1). Рекомбинантные ScFv нужной специфичности получают технологией фаг-дисплея – Antibody Phage Display.

С помощью приведённой методики можно работать с любой другой рекомбинантной конструкцией, имеющей промотор гена LacZ.

 

Оборудование и материалы

Штамм E. coli JS5, содержащий фагмиду pHEN1 с геном миниантитела scFv, центрифуга, шейкер.

Растворы

-Среда 2YT (тема 1).

-Ампициллин. Раствор 100 мг/мл в воде.

-40% глюкоза.

-1М ИПТГ.Раствор 154 мг/мл в воде.

-50мМ NaCl.

 

Методика

1. Посеять клетки штамма E. coli JS5 (pHEN1:: scFv), содержащие фагмиду с клонированным геном миниантитела в 10 мл среды 2YT. Среда должна  содержать 100 мкг/мл антибиотика ампициллина и 1 % глюкозы. Для этого в пробирку с культурой добавить 10 мкл стокового раствора ампициллина и 250 мкл 40% глюкозы. Наращивать в течение ночи с аэрацией при 37°С.

2. Ночную культуру развести в 100 раз той же средой (вылить 10 мл в колбу с 1 л среды) и растить при 25°С до оптической плотности 0, 5 при 600 нм.

3. Клетки осадить в центрифуге при 4000 об/мин в течение 10 мин.

4. Ресуспензировать клетки в 50 мл 50мМ раствора NaCl для отмывки от глюкозы.

5. Снова осадить клетки при 4000 об/мин в течение 10 мин.

6. Добавить к отмытым клеткам индуктор. Для этого ресуспензировать осадок клеток сначала в малом объёме, а затем в 1 л среды 2YT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1мМ ИПТГ. Для получения необходимых конечных концентраций добавить в 1-литровую колбу       1000 мкл стокового раствора антибиотика и 1000 мкл стокового раствора индуктора ИПТГ.

7. Клетки инкубировать в течение 3 ч при 25°С на шейкере. При пониженной по сравнению с 37º С температуре накопление рекомбинантного белка идёт лучше и не бывает самолизиса культуры при суперпродукции.

8. Остановить рост бактериальной культуры, поставив колбу в холодильник на +4º С, после чего выделить рекомбинантные миниантитела.

Работа 9.2. Выделение белка из периплазмы клеток E. coli

 

Для удобства последующего отделения целевого белка от других белков E. coli его можно направить в периплазму клетки сразу после завершения синтеза в цитоплазме на рибосомах. Периплазматическое пространство – это пространство между наружной цитоплазматической мембраной и оболочкой клетки (пептидогликановым слоем). Для этого при клонировании используют соответствующий вектор. Генно-инженерная конструкция должна за промотором LacZ («под промотором») содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие определённый лидерный пептид. Например, лидер гена пектатлиазы pelB бактерии Erwinia carotovora.

 

Этот лидер есть в фагмиде pHEN1 (Hoogenboom et al., 1991). При трансляции конструкта получается ковалентносшитый fusion-белок (фьюжен: лидерный пептид – целевой белок), который накапливается в периплазме клетки и, поэтому, отделить его от внутриклеточных белков будет несложно. Хроматографии для этого не потребуется. Лидерный пептид на свойства целевого белка существенного влияния не оказывает. Из периплазмы клеток накопленный протеин легко выделить. Он просто выходит в раствор после помещения клеток в высокосолевой буфер. Приведён боратный метод выделения периплазматических белков.

 

Оборудование и материалы

Штамм E. coli JS5, содержащий фагмиду pHEN1 с клонированным геном миниантитела scFv, высокоскоростная центрифуга.

Растворы

- Боратный раствор.200мМ борат натрия; 60мМ NaCl; 1мМ ЭДТА.

- Ингибитор протеиназ PMSF или лейпептин. Раствор 1 мг/мл.

Методика

1. Культуру клеток после завершения времени инкубации с индуктором охладить во льду в течение 20 мин. За это время прекращаются основные биохимические процессы, не будет продуктов незавершённого синтеза.

2. Охлаждённую во льду культуру клеток осадить центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин при +4°С.

3. Супернатант слить, а к осадку клеток добавить 10 мл охлаждённого         200мМ бората натрия с 160мМ NaCl и 1мМ ЭДТА. Тщательно пипетировать. Клетки как бы «сморщиваются» в высокосолевом буфере, scFv при этом «выдавливаются» из периплазмы в раствор.

4. Избавиться от клеток вместе со всеми цитоплазматическими белками центрифугированием в течение 10 мин при 4000 об/мин. В супернатанте останутся только белки периплазмы с преобладанием целевого белка.

5. Супернатант очистить от клеточного дебриса центрифугированием при 20000 об/мин в течение 30 мин. Добавить в препарат белка ингибитор сериновых протеаз PMSF или лейпептин, 1 мкл стока на 1 мл препарата. 

 

Работа 9.3. Диализ препарата белка

 

Выделенный боратным методом периплазматический белок содержит значительные количества низкомолекулярных примесей, прежде всего солей. Избавиться от них можно диализом препарата. Раствор белка помещают в диализный мешок, стенки которого представляют собой полупроницаемую целлюлозную мембрану, не пропускающую молекулы размером более 15–20 kDa. Мешок погружают в буферный раствор. Объём наружного буфера должен многократно превышать объём мешка. Низкомолекулярные вещества в результате осмоса могут проходить через мембрану в буфер. Обессоленный раствор белка, молекулы которого имеют размер больше чем 20 kDa, остается в диализном мешке.       

 

Материалы и оборудование

Препарат белка, диализный мешок, стакан на 2000 мл, магнитная мешалка, стеклянная палочка или пипетка.

Растворы

-Буфер PBS. На приготовление 1 л: NaCl – 5, 84 г; Na₂HPO₄ – 4, 72 г;              NaH₂PO₄ ´ H₂O – 2, 64 г; pH 7, 2.   

Методика

1. Перенести с помощью микропипетки раствор белка в диализный мешок.

2. Завязать мешок и с помощью отрезка резиновой трубки или резиновой полоски закрепить на середине стеклянной палочки или пипетки.

3. Опустить мешок в доверху наполненный 1000 мл стакан с фосфатным буфером PBS, положив стеклянную палочку на края стакана. Поставить стакан на размещённую в холодильнике магнитную мешалку и включить.

4. На следующее утро заменить буфер свежим и диализовать еще 4–6 ч.

5. Определить концентрацию белка. Полученные миниантитела scFv пригодны для иммунодота, блоттинга и иммунодиффузии.   

 

Тема 10. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА

 

Основными методами для определения концентрации белка в растворе являются следующие методы: 1) биуретовая реакция с использованием щелочного раствора соли меди, 2) метод Лоури с применением реактива Лоури-Фолина, 3) измерение оптической плотности в УФ области спектра при 280 нм (полоса поглощения ароматических аминокислот) или 205–220 нм (полоса поглощения пептидных групп), 4) связывание красителя кумасси бриллиантового голубого Coomassie Brilliant Blue R –250 – метод Бредфорда.

 

Метод Бредфорд а ( Bradford, 1976 ) и метод Лоури ( Lowry, 1951 ) – два наиболее известных аналитических метода. Статья Лоури с соавт. ( Lowr у et al., J. Biol. Chem., 1951, V.193, P.265 – 275) является самой цитируемой научной статьёй в мире. По надёжности оба этих колориметрических метода одинаковы, использование обоих может понадобиться для контроля.

 

Работа 10.1. Метод Бредфорда

Краситель Coomassie Brilliant Blue R –250 при растворении в фосфорной кислоте имеет красно-коричневую окраску (анионная форма), но при связывании с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками белка развивается голубая окраска (λ _max = 595 нм, катионная форма). Таким  образом, увеличение абсорбции раствора при длине волны равной 595 нм пропорционально количеству белка в растворе.

 

Метод заключается в добавлении красителя к раствору белка и измерению оптической плотности. Полученные значения сравнивают с калибровочной кривой, построенной по белку с известной концентрацией, чаще всего по бычьему сывороточному альбумину (БСА). 

По сравнению с методом Лоури метод Бредфорда проще, быстрее и отличается большей чувствительностью при такой же точности. Даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл.   

 

Материалы и оборудование

Спектрофотометр, кюветы, раствор БСА (10 мг/мл), раствор исследуемого белка, краситель кумасси R–250, ортофосфорная кислота.

Растворы

- Реагент Брэдфорда.На 1л: 100 мг кумасси R–250 растворить в 50 мл спирта и добавить 100 мл ортофосфорной кислоты, довести до 1 л водой и профильтровать через бумажный фильтр. Реагент очень чувствителен к белку (1–2 мкг/мл). Все должно быть абсолютно чистым, иначе раствор посинеет и испортится. Чистый раствор имеет коричневый цвет.

Методика

1. Довести объём образца до 0, 5 мл водой.

2. Добавить 0, 5 мл реагента Бредфорда.

3. Перемешать и ждать развития окраски (от 5 с, но не более 30 мин).

4. Измерить A₅₉₅ в 1 мл кювете.

5. Рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой, построенной по БСА.

 

 

Работа 10.2. Метод Лоури

 

Метод Лоури основан на образовании окрашенных продуктов реакции ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.

 

В щелочной среде при взаимодействии сульфата меди II с пептидными группами белка –СО–NH– образуются комплексные соединения фиолетовой окраски, ионы Cu²⁺ при этом переходят в Cu⁺. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина, образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь с максимумом поглощения при 750 нм. Увеличение абсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка.

Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей, что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах. Чувствительность к белку – 10–100 мкг/мл.

Материалы и оборудование

Спектрофотометр, кюветы, тщательно вымытые и просушенные, раствор БСА (10 мг/мл), раствор исследуемого белка, реагенты.

Растворы

-Реагенты A и B для метода Лоури: раствор А – 2% Na₂CO₃; раствор В –   5% CuSO₄ ´ 5H₂O в 1% цитрате Na.

- 50 % трихлоруксусная кислота (ТХУ). Хранить в темноте под тягой.

- Реактив Фолина. Приготовление реактива на 1 л: 100 г Na₂WO₄ ´ 2H₂O и 25 г Na₂MoO₄ ´ 2H₂O растворить в 700 мл воды в круглодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным обратным холодильником Либиха. Прибавить 50 мл 50%-ной H₃PO₄ и 100 мл HCl (конц.). Поместить в колбу несколько капилляров (центров кипения) и кипятить в течение 10 ч. Затем прибавить 150 г Li₂SO₄, 50 мл воды и несколько капель брома. Отсоединив обратный холодильник кипятить содержимое колбы под тягой 15 мин для удаления избытков брома. Охладить, довести водой до 1 л, перелить в склянку из тёмного стекла.

Методика

1. Довести объём образца до 0, 8 мл водой.

2. Добавить 0, 2 мл 50% ТХУ (конечная концентрация 10%), перемешать.

3. Подождать 10 мин, центрифугировать 10 мин при 14000 об/мин.

4. Супернатант слить и добавить к осадку 150 мкл 1М NaOH, 50 мкл     10% SDS, 0, 75 мл раствора D (смесь А и В, 50: 1), 50 мкл реактива Фолина. Перемешать и ждать развития окраски 30 мин.

5. Измерить A₇₅₀ в 1 мл кювете.

6. Рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой.

 

Работа 10.3. Концентрирование белков путем осаждения ТХУ

Метод осаждения белков трихлоруксусной кислотой полезен, когда концентрация белка в коллоидном растворе слишком мала для анализа или объём раствора слишком велик, чтобы нанести нужное количество белка в лунку геля при электрофорезе. Осадок растворяют в меньшем объёме буфера, концентрируя, таким образом, раствор белка.

 

Материалы и оборудование

ТХУ, дезоксихолат натрия, раствор белка БСА, раствор исследуемого белка, центрифуга.

Растворы

- Трихлоруксусная кислота (ТХУ).

- 0, 15% дезоксихолат натрия. Хранить при комнатной  температуре.

Методика

1. Если минимальная концентрация белка порядка 5 мкг/мл, то к раствору белка добавить 1/10 объёма 100% ТХУ.

2. Если минимальная концентрация белка меньше 1 мкг/мл, то к раствору белка добавить 1/10 объёма 0, 15% дезоксихолата натрия (соосадитель), выдержать 10 мин при комнатной температуре и добавить 1/20 первоначального объёма 100% ТХУ.

3. Инкубировать 30 мин на льду или 15 мин при –20°C.

4. Центрифугировать 5–10 мин при максимальной скорости центрифуги.

5. Отобрать супернатант пипеткой. Белок – в осадке.

6. Далее можно растворить осадок в 50–100 мкл 0, 1н NaOH и промыть 1 мл смеси этанол–эфир 1: 1. Для полного удаления остатков ТХУ промывать нужно тщательно, несколько раз подряд.

7. Центрифугировать на максимальной скорости микроцентрифуги. Супернатант отбросить. Осадок белка растворить в буфере PBS.

 

Тема 11. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ

Гель-электрофорез – один из стандартных молекулярно-биологических методов анализа. Молекулы белка в растворе обладают зарядом при любом значении pH, отличном от их изоэлектрической точки. Это обуславливает их подвижность в электрическом поле. Разделяют белки в полиакриламидных гелях (ПААГ), имеющих по сравнению с агарозными гелями меньший размер пор. Гель образуется в результате полимеризации мономерных молекул акриламида в присутствии N, N’-метилен-бис-акриламида, формирующего поперечные сшивки. Варьированием концентрации мономеров можно добиваться получения пор различного размера. ПАА-гели плотнее агарозных, устойчивы к кипячению в воде, пластичные и менее ломкие.

 

ПААГ состоит из зон концентрирующего и разрешающего геля.  Концентрация акриламида в разрешающем геле зависит от размеров белка – для крупных белков используют гели с низкой концентрацией, начиная от 5% и выше, менее крупные белки разделяют в мелкопористых гелях, содержащих до 20–25% акриламида. Заливка геля и электрофоретическое разделение белков в пластине геля происходит в вертикальном положении.

 

Разработано большое количество модификаций метода электро-фореза белков в ПААГ для решения различных задач и для разных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия (хаотропный агент, ПАВ) по Лэммли (Laemmli, 1970). Далее приведена одна из модификаций этого метода.

 

 

Работа 11.1. Приготовление растворов и заливка ПААГ

Подготовка к электрофорезу белков по сравнению с электрофорезом ДНК занимает больше времени. Полиакриламидный гель обычно готовят заранее, используя для этого стоковые растворы.

 

Концентрирующий гель обычно имеет концентрацию полиакриаламида от 2 до 8% и значение pH 6, 8. Разделяющий гель имеет концентрацию полиакриламида от 5 до 20% и pH в районе 8, 5–8, 9. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков. В качестве электродного буфера чаще всего используют Tris–глициновый или Tris–боратный буфер с водородным показателем среды pH 8–9.

 

Материалы и оборудование

Аппарат для вертикального электрофореза, источник постоянного тока, стеклянные пластины с вырезом и без выреза, гребёнка, спейсеры, шприц для нанесения образцов, реактивы для приготовления ПААГ и буферов.

 

Растворы

1.Электродный буфер (200 мл)
Tris–OH (трис(гидроксиметил)аминометан)	3, 03 г
Глицин	14, 44 г
SDS	1, 0 г
Н2О (бидистиллированная, деионизированная, здесь и далее)	до 200 мл
pH 8, 4, p -р глицина титруют до нужного знач. pH сухим Tris;
SDS добавлять последним, после доведения pH
2.Раствор АА /бисАА
АА (акриламид)	30, 0 г
бисАА (N, N’-метилен-бис-акриламид)	0, 8 г
Н2О	до 100 мл
3 Буфер 1 (для концентрирующего геля)
Tris–HCl (трис-гидрохлорид)	6, 06 г
SDS	0, 4 г
Н2О	до 100 мл
pH 6, 8, титровать 4–6 н HCl, перед добавлением SDS
4 Буфер 2 (нижний буфер для разделяющего геля)
Tris–OH (трис(гидроксиметил)аминометан)	18, 17 г
SDS	0, 4 г
Н2О	до 100 мл
pH 8, 8, титровать до нужного значения HCl, перед SDS
5 БФС (бромфеноловый синий)	2 мг
Н2О	до 4 мл
6.Краситель (0, 125% кумасси R–250)
Coomassie Briiliant Blue R–250 (у G–250 разрешение меньше)	1, 25 мг
Этанол	5 мл
Уксусная к-та (10%)	1 мл
Н2О	до 10 мл
7. Отмывающий раствор I (50% этанол, 10% уксус. к-та)
Уксусная к-та (10%)	10 мл
Этанол (50%)	50 мл
Н2О	до 100 мл
Перед использованием развести в 5 раз
8 Отмывающий раствор II (5% этанол, 10% уксусная к-та)
Уксусная к-та (10%)	35 мл
Этанол (50%)	25 мл
Н2О	до 100 мл
Перед использованием развести в 5 раз
2 ´ буфер для образцов
Глицерин 15%	7, 5 мл
β -меркаптоэтанол	2, 5 мл
SDS	1, 15 г
Tris–HCl (трис-гидрохлорид)	0, 38 г
Н2О, pH 6, 8	до 25 мл
- 10% ТХУ,
- 5% ПСА (персульфат аммония),
- ТЕМЕД (N, N, N, N-тетраметилэтилендиамин).

 

 

Подготовка стёкол для заливки полиакриламидного геля

1. Взять стекло с вырезом и поместить по его боковым краям два спейсера. 

2. Сверху положить на спейсеры стекло без выреза. Осторожно поставить собранную конструкцию в камеру вертикально так, чтобы можно было залить гель в полость между стеклами. Стекло без выреза должно быть обращено наружу, к исследователю. Закрепить конструкцию зажимами.

3. Расплавить 3% агарозу, охладить до 50–60º С и залить тонким слоем (5 мм) дно электрофорезной ячейки во избежание протекания гелевого раствора.

Заливка геля

1. Для приготовления разделяющего геля смешать компоненты ^а (за исключением ТЕМЕД и ПСА) в соответствии с данными, приведёнными в табл. 3 (для разных объёмов! ). Полученную смесь тщательно перемешать ^б.

                   

                 Таблица 3. Подготовка разделяющего геля

 

Компонент	3%	6%	10%	20%
Р-р АА/бисАА	1 мл	3 мл	4, 95 мл	13, 34 мл
Буфер 2	2, 5 мл	3, 75 мл	3, 75 мл	5 мл
Н2О	6, 5 мл	8, 25 мл	6, 3 мл	1, 66 мл
ТЕМЕД	10 мкл	15 мкл	15 мкл	40 мкл
ПСА 5%	30 мкл	45 мкл	45 мкл	120 мкл
V общий	10 мл	15 мл	15 мл	20 мл

 

2. Добавить последовательно ТЕМЕД и ПСА и тщательно перемешать полученный раствор, при этом важно, чтобы в процессе перемешивания не образовывались пузырьки с газом.

3. Полученный раствор разделяющего геля аккуратно залить между стеклянными пластинами так, чтобы уровень не превышал 3 см от верхнего края пластин.

4. Осторожно наслоить на раствор разделяющего геля тонкий слой метанола или деионизированной воды и оставить гель застывать (до 20 мин).

5. Приготовить раствор концентрирующего геля как указано в табл. 4.

6. Удалить слой метанола (! ) или воды с поверхности застывшего разделяющего геля фильтровальной бумагой.

7. Наслоить на поверхность застывшего разделяющего геля раствор концентрирующего геля, и немедленно после этого вставить гребёнку между стеклянными пластинами.

 

 

Таблица 4. Подготовка концентрирующего геля

 

 

Компонент	6%	10%
Р-р АА/бисАА	2 мл	3, 3 мл
Буфер 1	2, 5 мл	2, 5 мл
Н2О	5, 5 мл	4, 2
ТЕМЕД	20 мкл	10 мкл
ПСА 5%	60 мкл	30 мкл
V общий	10 мл	10 мл

 

8. Оставить гель застывать в течение 20 мин ^в. Удобно отлить немного из остатков гелевого раствора в 1, 7 мл пробирку и использовать этот раствор как индикатор полимеризации.

Подготовка камеры к электрофорезу

1. Поставить электрофорезную камеру на ровную горизонтальную поверхность. Добавить электродный буфер в верхнюю ёмкость камеры так, чтобы уровень буфера был на 0, 5 см выше уровня геля.

2. Добавить электродный буфер в нижний поддон камеры.

3. Осторожно удалить гребенку и промыть лунки электрофорезным буфером с помощью шприца или микропипетки.

 

Примечания

^а Готовый стоковый раствор для геля нужной концентрации без ТЕМЕД и ПСА можно хранить в холодильнике около года. Акриламид токсичен, работать в перчатках!

^б  В 15% ПАА-гелях эффективно разделяются белки с диапазоном молекулярных масс 10–45 kDa, в 10% гелях – 14–205 kDa, в 7, 5% – 24–205 kDa, в 5% – 36–205 kDa.

 ^в Готовые гели можно хранить в холодильнике в обёрнутом виде, не вынимая гребёнки. Однако разделяющий и концентрирующий гели имеют разные буферы, поэтому лучше залитый гель использовать сразу. 

 

 

Работа 11.2. Проведение электрофореза белков

Молекула белка в растворе имеет некий средний целочисленный заряд (положительный или отрицательный) при любом значении pH, отличающемся от изоэлектрической точки данного белка. Это обуславливает передвижение молекул в полиакриламидном геле под действием внешнего электрического поля. Кроме заряда на подвижность влияет размер белковых молекул.

 

Электрофорез проводят обычно при нейтральных или слабощелочных значениях pH, когда большинство белков мигрирует к аноду, так же как мигрирует при электрофорезе ДНК. За прохождением электрофореза следят по движению красителя бромфенолового синего (БФС). Краситель идёт с фронтом фореза, впереди него белков нет.

 

Материалы и оборудование

Электрофорезная камера с гелем, источник тока, образцы белков для анализа, маркеры молекулярного веса.

 

Растворы

-2´ буфер для нанесения образцов (работа 11.1).

-Раствор БФС (работа 11.1).

Методика

1. Подготовить образцы так, чтобы общая концентрация белка была не больше 10 мг/мл. Нужно 10 мкл образца разбавить 2´ буфером для нанесения образцовв два раза, добавить 4 мкл раствора БФС. Рекомендуется прокипятить образцы в течение 5 мин.

2. С помощью гамильтоновского шприца или микропипетки-дозатора с вытянутым наконечником нанести по 10 мкл образцов в лунки геля.

3. Подключить электрофорезную камеру к источнику тока, соблюдая полярность.

4. Провести электрофоретическое разделение белков при постоянном токе 20 мА, 60 В для одного геля и 60 мА, 150 В для другого геля. Повышать напряжение надо при прохождении БФС до разделяющего, нижнего геля. В этих условиях электрофорез длится 40–50 мин.

5. По достижению красителем нижнего края геля отключить ток.

6. Вынуть пластину с гелем из электрофорезной камеры.     

7. Осторожно вынуть спейсеры, находящиеся между стеклами.

8. Отделить гель от стёкол ^а, окрасить.

Примечаниe

^а Для придания стёклам гидрофобных свойств для лучшего отделения геля их зачастую предварительно силиконируют с использованием bind-silane и repel-silane.

Работа 11.3. Окрашивание белков Coomassie R –250

Обработка полиакриламидных гелей после электрофореза включает окрашивание и отмывку от несвязавшегося красителя. Гель заливают трихлоруксусной кислотой, тщательно отмывают водой и помещают в раствор красителя кумасси бриллиантового голубого Co o umassi e R–250.

 

Молекулы красителя связываются с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками. Связанная форма имеет синюю окраску, поэтому на геле видны полосы белка с разной интенсивностью окраски, коррелирующей с количеством белка.

После окрашивания белковых полос гель необходимо отмыть от несвязавшегося красителя Co o umassi e R–250. Отмывают гели в растворах этанола (или метанола – яд! ) и уксусной кислоты.

Материалы и оборудование

Полиакриламидный гель с результатами электрофореза белков. 

 

Растворы

-10% ТХУ (работа 11.1).

-Раствор кумасси R–250   (работа 11.1).

-Отмывающий раствор I(работа 11.1).

-Отмывающий раствор II(работа 11.1).

Методика

1. Сразу после электрофореза поместить гель в емкость для отмывки, залить 10% ТХУ, оставить на 30–60 мин. Можно заменить ТХУ на 5мM HCl.

2. Добавить воду, хрошо промыть, слить воду.

3. Поместить гель в раствор кумасси для окрашивания ^a на 1–1, 5 ч.

4. Слить раствор кумасси и залить отмывающий раствор I ^б на 1–1, 5 ч.

5. Удалить отмывающий раствор I.

6. Поместить гель в отмывающий раствор II, и оставить на время пока с геля не исчезнет фон. В процессе проявления геля рекомендуется 2–3 раза менять отмывающий раствор II.

Примечания

^a  Чувствительность на порядок выше даёт окрашивание белков ионами серебра. После обработки геля уксусной кислотой и этанолом в растворе I, тщательной промывки этанолом и водой гель переносят на 30 минут в 5 объёмов 0, 1% раствора AgNO3. Затем после промывки водой помещают в такой же объём 0, 28М карбоната натрия с добавлением до 0, 02% формальдегида. Окрашенные полосы белка появляются через несколько минут. Следует дождаться наилучшего контраста и остановить реакцию промывкой в 10% уксусной кислоте.

^б  Как альтернатива: гель заливают холодной водой (200–300 мл), и кипятят ~5'.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: