VI. ПОРЯДОК ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ НАНОЧАСТИЦ И НАНОМАТЕРИАЛОВ

Требования к используемой аппаратуре

6.1.1. Для реализации метода применяются просвечивающие электронные микроскопы, оборудованные системой цифровой регистрации изображений и имеющие в своем составе модули для измерения дифракции электронов и спектров характеристических потерь энергии электронами, со следующими параметрами:

- величина ускоряющего напряжения электронов не менее 80 кВ

- максимальное увеличение не менее 100000

- диапазон увеличений в режиме СХПЭЭ не уже чем от 20 до 300

- система фильтрации электронов по энергии и параллельная детектирующая система спектров потерь энергии с разрешением по энергии не хуже 2 эВ и областью изменения энергии в диапазоне от 0 до 1000 эВ или больше

- наличие режима дифракции параллельного пучка электронов. В этом режиме апертурная диафрагма должна избирательно ограничивать освещаемую область образца в диапазоне размеров (по диаметру) от 1 до 50 мкм или в более широком диапазоне.

- предельное разрешение двух точек (по техническому паспорту) не хуже 0, 4 нм;

- предельное разрешение двух линий (по техническому паспорту) не хуже 0, 25 нм.

        Примеры аппаратуры, удовлетворяющей указанным требованиям, приведены в справочном приложении.

      6.1.2. Подготовка электронного микроскопа к работе.

Ежедневно после включения микроскопа проверяются и корректируются (при необходимости) следующие настройки:

- настройка катода и наклон источника освещения.

Оптимальный режим накала устанавливается по изображению катода на люминесцентном экране ПЭМ, а именно, по изображению кроссовера. Нарушение ориентировки пушки устраняется путём изменения её угла наклона (в соответствии с инструкцией к конкретному прибору).

- настройка конденсорной диафрагмы.

При сведении (фокусировке) и разведении (дефокусировке) луча на люминесцентном экране освещённая область должна симметрично приближаться к центру (при фокусировке) или к краям экрана (при дефокусировке).

- коррекция астигматизма конденсорной линзы (астигматизма пятна).

При сведении луча освещённое пятно на экране должно иметь форму круга, а не эллипса.

- настройка объективной диафрагмы

Объективная диафрагма должна быть отцентрирована. Следует отметить, что срок службы объективных диафрагм в среднем составляет около 3-х лет, после чего их следует заменять. Старые загрязнённые диафрагмы могу стать причиной ухудшения качества изображения

- коррекция астигматизма проекционной линзы.

Проверяется и настраивается в режиме дифракции по форме каустики. Кроме того, одним из признаков появления астигматизма является смещение изображения в стороны при настройке фокуса (при скорректированном астигматизме оно может лишь вращаться вокруг центральной оси).

Раз в неделю, а также при возникновении подозрения на нарушение коррекции астигматизма проверяется и корректируется

- коррекция астигматизма объективной линзы

Проверка и коррекция проводится с помощью тест-образца, имеющего неоднородности с чёткими краями (рекомендуется использовать углеродную пленку с дырочками), по симметричности (должны быть симметричны) полос Френеля, формирующихся на краях неоднородностей (на краях дырочек в углеродной пленке), при фокусировке и дефокусировке изображения (выполняется путем дефокусировки линз объектива). Возникновение такого астигматизма может быть связано с загрязнением электронной оптики. До принятия ГОСТа, регламентирующего стандартные образцы для коррекции астигматизма, рекомендуется использовать образец «astigmatism сorrection holey carbon film» (каталожный номер 609, фирмы «Ted Pella. Inc.», США), который соответствует стандарту ISO9001/9002.

Детальные инструкции по проверке и коррекции перечисленных выше настроек приведены в инструкциях к конкретным электронным микроскопам. Неправильные настройки и нескорректированный астигматизм линз приводят к ухудшению качества изображения.

6.1.3. Плановая проверка качества настройки электронного микроскопа.

 Не реже 1 раза в месяц проверяется правильность настройки микроскопа, включая следующие параметры: разрешающая способность микроскопа, калибровка масштаба изображения на ПЗС камере при различных коэффициентах увеличения (в первую очередь в рабочем диапазоне увеличений). Выбираются ускоряющее напряжение и параметры линз объектива, при которых будут проводиться измерения дифракции электронов, при этих параметрах измеряется дифракция электронов от стандартного образца и, при необходимости, определяется специальный коэффициент, обеспечивающий пересчет диаметров окружностей на дифракционной картине в межплоскостные расстояния кристаллической решетки для анализируемых образцов. Для проверки перечисленных параметров используются соответствующие стандартные образцы. Поверка осуществляется в соответствии с документацией производителя электронного микроскопа и действующими СОП.

Разрешающая способность проверяется путем получения изображений от кристаллов, в которых должны быть видны (разрешены) плоскости кристаллической решетки. В зависимости от предельной разрешающей способности микроскопа в качестве стандартных рекомендуется использовать следующие образцы: кристаллы асбеста-крокидолита (межплоскостные расстояния 0, 903 и 0, 452 нм; опасен для здоровья – использовать с осторожностью! ), кристаллы фталоцианина меди (межплоскостные расстояния 1, 03 нм), графитизированный углерод (межплоскостные расстояния 0, 34 нм), ориентированные кристаллы золота (межплоскостные расстояния 0, 204, 0, 143 и 0, 102 нм). До принятия ГОСТа, регламентирующего стандартные образцы для поверки разрешающей способности электронных микроскопов, рекомендуется применять следующие образцы фирмы «Ted Pella. Inc.», США, соответствующие стандарту ISO9001/9002: аsbestos-сrocidolite (каталожный номер 624), copper phthalocyanin (каталожный номер 629-1), graphitized carbon black(каталожный номер 645), orientated gold crystals(каталожный номер 646).

Для калибровки линейных размеров при измерениях с помощью электронных микроскопов используется электронно-прозрачный стандартный образец с регулярными неоднородностями, расстояние между которыми известно (например, реплики дифракционных решеток с известным расстоянием между штрихами). Калибровку производят, получая изображения реплики дифракционной решетки при различных значениях увеличения микроскопа (Г), используемых в анализе наночастиц и фиксированной дискретности оцифровки изображений (фиксированный размер цифрового изображения X´ Y в пикселах). По полученным цифровым изображениям выбирают два крайних штриха (крайний левый и крайний правый или крайний верхний и крайний нижний в зависимости от ориентации решетки), подсчитывают число промежутков между этими штрихами на изображении (n) и число пикселов цифрового изображения, соответствующих расстоянию между крайними штрихами (p). Масштаб (M) цифрового изображения при неизменных параметрах Г и X´ Y рассчитывают в единицах нм/пиксел по формуле:

М (Г, X´ Y)= n´ l/p,

где l – это известное (стандартное) расстояние между штрихами решетки в нм.

Масштабирование выполняют для фиксированного набора увеличений микроскопа Г и фиксированного размера цифрового изображения X´ Y. В дальнейшем при анализе наночастиц регистрацию изображений выполняют только при тех значениях Г и X´ Y, при которых проведена калибровка масштаба М.

Для проведения калибровки увеличения микроскопа и масштабирования цифровых изображений могут быть использованы специальные программные опции, предусмотренные в программном обеспечении к электронному микроскопу. Эти опции облегчают проведение калибровки и обеспечивают автоматическое введение масштаба или масштабных меток в цифровые изображения. 

До принятия ГОСТа, регламентирующего стандартные образцы для калибровки линейных размеров при измерениях с помощью электронных микроскопов, рекомендуется применять следующий образец фирмы «Ted Pella. Inc.», США, соответствующий стандарту ISO9001/9002: magnification calibration diffraction grating replica (каталожный номер 606).

Для более точного определения размеров наночастиц рекомендуется:

 − анализ исследуемых образцов выполнять при том же значении тока объективной линзы, при котором выполнялась калибровка увеличения и масштаба с применением стандартного образца;

− обеспечить одинаковое положение образцов (стандартного и анализируемых) в держателе образцов, а также одинаковое положение держателя в приборе;

− обеспечить одинаковую ориентацию образцов (стандартного и анализируемых) в держателе, то есть всегда либо подложкой вверх, либо подложкой вниз.

− не использовать искривлённые сеточки и бленды.

При выборе и контроле параметров для проведения измерений дифракции электронов применяется стандартный поликристаллический образец, для которого известны межплоскостные расстояния кристаллической решетки. С использованием этого образца контролируется стабильность параметров, влияющих на точность и воспроизводимость дифракционного анализа, таких как токи линз, значение напряжения и расстояние от образца в держателе до матрицы ПЗС. На основе дифракционной картины, измеренной от стандартного образца, определяют и корректируют специальный коэффициент, с помощью которого возможен пересчет диаметров окружностей на дифракционной картине в межплоскостные расстояния кристаллической решетки для анализируемых образцов.

До принятия ГОСТа, регламентирующего стандартные образцы для контроля параметров микроскопа при дифракции электронов, рекомендуется применять следующий образец фирмы «Ted Pella. Inc.», США, соответствующий стандарту ISO9001/9002: diffraction standard evaporated aluminum (каталожный номер 619).

Проверка и калибровка энергетического фильтра, используемого в режиме СХПЭЭ, должна выполняться сертифицированным специалистом по обслуживанию электронных микроскопов данной марки. 

6.1.4. Внеплановые проверки качества настройки электронного микроскопа

Внеплановая проверка качества настройки электронного микроскопа проводится, если в процессе измерений выявляются артефакты, которые, по мнению оператора, могут быть связаны с разъюстировкой микроскопа. Если очередная или внеочередная проверка выявила существенную разъюстировку микроскопа по одному или нескольким из перечисленных выше параметров, то определение наночастиц в образцах проводиться не может до устранения неисправности.   

6.1.5. Основные требования к электронному микроскопу, применяемому для визуализации и идентификации наночастиц.

Электронный микроскоп может применяться для определения наночастиц в образцах и пробах, если при проверке правильности настройки микроскопа, получены следующие результаты:

- тест на разрешающую способность подтверждает, что разрешение микроскопа не хуже 0, 5 нм;

- удалось добиться эффективной коррекции астигматизма;

- масштаб изображений откалиброван с точностью до 5%.

- измерена длина камеры (расстояние между образцом и ПЗС-матрицей) и определены ускоряющее напряжение и параметры линз объектива, при которых будут проводиться измерения дифракции электронов в исследуемых образцах.

 6.2. Требования к вспомогательному оборудованию, помещениям, техническому оснащению

6.2.1. Помещения, в которых располагается оборудование для электронно-микроскопических исследований, должны отвечать следующим требованиям.

Микроскоп должен быть установлен в помещении такой площади, чтобы расстояние от боковых и задней частей микроскопа до стен было не менее 1 м с высотой потолка 2, 5 м. Температура воздуха в помещении 18-25 °C, а максимальный дрейф температуры не превышает 3º С/час, если иное не указано в техническом паспорте к конкретному электронному микроскопу.Влажность в помещении – (65±15) %, напряженность магнитного поля – не более 0, 2 мкТл, вибрация пола – не более 0, 2 мм/сек для 5-50 Гц, если иное не указано в техническом паспорте к конкретному электронному микроскопу.

6.2.2. Электропроводка должна соответствовать мощности электронного микроскопа. Сопротивление заземляющего контура - не более 4 Ом.

6.2.3. Помещение должно быть оборудовано водопроводом с подачей воды 0, 3 м³/час (15±5°C) с дренажной системой. Выброс воздуха из вакуумного насоса должен быть выведен наружу и оборудован воздушным фильтром для улавливания проскочивших наночастиц.

6.2.4. Должны быть соблюдены дополнительные требования к помещению, такие как, например, требования к кондиционированию воздуха, подаче азота и т.п., если эти требования указаны в техническом паспорте к конкретному электронному микроскопу.

6.2.5. При подготовке образцов к электронно-микроскопическому исследованию, применяется вспомогательное оборудование, характеризуемое следующими параметрами:

    − Ультрамикротом, обеспечивающий получение ультратонких срезов биологических и физических образцов толщиной 30-100 нм, скорость резания 0, 4 - 1 мм/с, термоподача 40 – 60 нм.

       − Прибор для изготовления стеклянных ножей для ультрамикротомов.

    − Стеклянные или алмазные ножи.

       − pH-метр, ± 0, 1 pH.

       − Весы, ± 0, 1 мг.

       − Центрифуга – 6000 об/мин, центрифугируемые объёмы от 1 см³ до 100 см³.

       − Термостаты: от 37º С до 110º С, ± 0, 1º С.

       − Дистиллятор.

       − Аппарат для перемешивания растворов (магнитная мешалка, механическая мешалка).

    − Электромешалка (для приготовления эпоксидных смол).

       − Л аминарный бокс биологической безопасности класс III или в ытяжной шкаф, оборудованный фильтром для улавливания наночастиц.

       − Холодильник – для проведения обработки образцов и хранения реактивов при +4º С, холодильник для хранения реактивов при -18 º С.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: