Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в тонкой структуре природных биопленок

Природные биопленки в окружающей среде представляют собой органические образования на поверхности некоторых конструкционных элементов промышленных и жилых зданий, на поверхности сооружений из кирпича, камня, бетона, металла, керамики, дерева, пластмассы, а также на поверхности отдельных агрегатов и деталей технологических линий, машин и приборов, образовавшихся в процессе жизнедеятельности природных (диких) микробов или ассоциаций бактерий, дрожжей, грибов и одноклеточных водорослей. В структуре природных биопленок микробы ассимилируют или депонируют все то, что содержатся в воздухе, воде, почве: химические элементы, наночастицы, органические молекулы, продукты распада и разложения материалов и т.д.

 Целью является определение наличия наночастиц в структуре природных биопленок, проведение структурной и морфометрической идентификация частиц в структуре биопленок и в живых микроорганизмах (бактериях, дрожжах, грибах и одноклеточных водорослях).

Образцы биопленки объемом 1-2 мм³ (10-15 кусочков) или биомассу в количестве 100-150 мг, собранную с поверхности конструкционных агрегатов или материалов, фиксируют и инактивируют 4, 0 % раствором глутарового альдегида на 0, 01 моль какодилатном буфере (рН 7, 2).

Схема проведения экспериментов электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в природных биопленках представлена в таблице 12.

Таблица 12

Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в тонкой структуре природных биопленок

Вид исследуемого материала	Биопленка или биомасса микроорганизмов, собранная с поверхности конструкционных материалов
Физическая форма исследуемого материала	Сухая или влажная биопленка (биомасса)
Количество материала для выполнения исследований	100-150 мг сухой или влажной биомассы или 10-15 кусочков биопленки величиной 1-2 мм3
Приборное обеспечение	Электронный микроскоп по п.6.1.1.; дополнительное оборудование по п.6.2.4.
Материалы	Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10× 20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки
Химические реактивы	Глутаровый альдегид, четырехокись осмия, какодилат натрия, этиловый спирт, абсолютный этиловый спирт или 100, 0 % ацетон, эпоксидные смолы (аралдит или эпон), формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, цитрат свинца, дистиллированная вода
репарирование образцов для исследования в электронном микроскопе	Этап 1(подготовка реактивов и материалов к эксперименту): – приготовление 4, 0 % раствора глутарового альдегида на 0, 01 моль какодилатном буфере            (рН 7, 2); – приготовление 2, 0 % раствора четырехокиси осмия на 0, 01 моль какодилатном буфере            (рН 7, 2); – приготовление батареи спиртов возрастающей концентрацией; – приготовление смеси абсолютного спирта и эпоксидной смолы (аралдита); – заливочная эпоксидная смола; – приготовление 0, 15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0, 5 % раствора коллодия на амилацетате; – покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой; – приготовление 1, 0 % раствора уранилацетата; –приготовление раствора цитрата свинца; – приготовление эпоксидной смолы Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии): – биомассу бактерий фиксируют и инактивируют в 4, 0 % растворе глутарового альдегида на         0, 01 моль какодилатном буфере (рН 7, 2); – бактерии дофиксируют в 2, 0 % растворе четырехокиси осмия на ацетат-вероналовом буфере (по Ритер, Келенбергеру) (рН 6, 0) или на 0, 01 моль какодилатном буфере (рН 7, 2);
	– образцы бактерий дегидратируют в нескольких сменах этилового спирта с возрастающей концентрацией, образцы выдерживают в трех сменах абсолютного этилового спирта или ацетона; – образцы бактерий пропитывают в трех сменах абсолютного этилового спирта и аралдита; – образцы бактерий заключают в аралдит и полимеризуют в течение 72 час при температуре 60 º С; – на ультрамикротоме стеклянным ножом из образцов биопленки получают ультратонкие срезы толщиной 30, 0-60, 0 нм; – ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой пленкой; – ультратонкие срезы наноматериала окрашивают цитратом свинца и 1, 0 % раствором уранилацетата.
Исследование ультраструктуры биопленки в просвечивающем электронном микроскопе	Согласно п.6.3.
Анализ электронно-микроскопических изображений ультраструктуры природной биопленки	Основные этапы: – визуализация наночастиц на ультратонких срезах биопленки; – морфометрический анализ наночастиц в структуре биопленки и клетках микроорганизмов; – определение степени полиморфизма наночастиц в структуре биопленки и клетках микроорганизмов; – определение степени агрегированности наночастиц в структуре биопленки; – оценка степени загруженности микробов наночастицами (число наночастиц на одну клетку)
Основные параметры и характеристики наночастиц в структуре природной биопленки для выдачи заключения	Структурные и морфометрические характеристики наноматериала: – наличие частиц размерами 1, 0-100, 0 нм в природной биопленке; – уровень электронно-оптической плотности частиц; – форма частиц; – коэффициент формы наночастиц; – степень полиморфизма наночастиц в материале; – степень агрегированности наночастиц в биопленке и в микробах; –характер распределения частиц в микробах; – степень загруженности микробов наночастицами; – характер повреждений ультраструктуры микробов наночастицами; –количество бактерий в биопленке с интактной ультраструктурой; – число бактерий в биопленке с летальными повреждениями и др.

 

Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в структуре биопленки содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемом материале, данные о степени агрегированности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в биопленке, число частиц на один микроб, характер и степень повреждения микроорганизмов наночастицами, электронно-микроскопические изображения структуры биопленки, наночастиц и микробов.

VII. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ АТОМНО-ЭМИССИОННОЙ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ С ИНДУКТИВНО СВЯЗАННОЙ ПЛАЗМОЙ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ НАНОМАТЕРИАЛОВ

Перечень индикаторных химических элементов для различных типов искусственных наноматериалов

В таблице 13 представлен список искусственных наноматериалов, приоритетных с точки зрения их определения в объектах окружающей среды и приведены маркёрные химические элементы, позволяющие осуществить количественное определение наноматериалов данного типа.

Принадлежность наноматериала к определённому классу тестируется предварительно методами ПЭМ с использованием дополнительных аналитических опций

 

 

Таблица 13

Список приоритетных наноматериалов и соответствующих индикаторных химических элементов для определения методами МС-ИСП и АЭС

№№ п/п	Тип наномате-риала	Индикаторный химический элемент	Возможности анализа (+/-)		Предел обнаружения мг/кг образца	Примечание
			МС-ИСП	АЭС
1.	Наночастицы золота	Au	+++	++	1*10-6	указаны пределы обнаруже-ния для современ-ных ИСП-МС измери-тельных комплек-сов с системами устранения полиатом-ных интерфе-ренций
2.	Наночастицы серебра	Ag	+++	++	1*10-6
3.	Наночастицы диоксида титана (анатаз, рутил)	Ti	+++	++	1*10-6
4	Наночастицы диоксида кремния (кварц, кремнезём)	Si	+++	++	5*10-6
5	Наночастицы оксида алюминия	Al	+++	++	1*10-6
6	Магнитные наночастицы	Fe Co Ni	+++	++	3*10-6
7	Наночастицы оксида церия	Ce	+++	++	1*10-6
8	Наночастицы глин	Al	+++	++	1*10-6
9	Квантовые точки	Cd Se Te As	+++	++	1*10-6
10	Наночастицы оксида цинка	Zn	+++	++	1*10-6
11	Наночастицы оксида меди	Cu	+++	++	1*10-6
11	Нанотрубки	Fe Co Ni Сu	+++	++	1*10-6

Требования к используемой аппаратуре

Используемые аналитические комплексы должны иметь возможность высокоточного многоэлементного анализа в широком линейном динамическом диапазоне, а также встроенную систему удаления полиатомных интерференций, основанную на физическом (столкновительном) принципе.

Требования к вспомогательному оборудованию, помещениям, техническому оснащению

Вспомогательное оборудование должно предоставлять возможность проведения серийной пробоподготовки для элементного анализа. Комплект оборудования должен включать:

1. Весы, точность до 0, 0001 г

2. Весы, точность до 0, 001 г

3. Систему для измельчения (гомогенизации) пробы.

4. Систему очистки кислот

5. Систему микроволнового разложения проб с наборами сосудов, в зависимости от анализируемых объектов.

6. Набор дозаторов и пластиковой посуды для растворения проб.

7.4. Выбор оптимального метода пробоподготовки

Согласно мировой практике использования оборудования и литературным данным, оптимальной методикой пробоподготовки перед проведением элементного анализа является измельчение пробы и микроволновое разложение.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: