Электронно-микроскопическое выявление и идентификация наночастиц в клетках, тканях и органах животных и растительных организмов
Задачи, которые решаются методами электронно-микроскопического анализа клеток, тканей и органов животных и растительных организмов:
(1) установление наличия техногенных наночастиц в клетках, тканях и органах;
(2) идентификация наночастиц;
(3) определение размеров и формы наночастиц;
(4) выявление тенденции к агрегированию наночастиц;
(5) установление распределения наночастиц по органам;
(6) установление распределения наночастиц по тканям и клеткам;
(7) ультраструктурный анализ локализации наночастиц в клетках и тканях;
(8) анализ наличия, характера и степени морфологических изменений в клеточных и тканевых структурах.
Набор конкретных задач электронно-микроскопических исследований определяется с учетом характера выполняемых контрольных мероприятий:
- первичное или уточняющее определение факторов (типов наночастиц), подлежащих периодическому контролю на предприятии наноиндустрии, в конкретной местности или локальной биосистеме;
- определение степени опасности наночастиц, производящихся, используемых или образующихся в виде побочных продуктов на предприятиях наноиндустрии;
- периодические контрольные мероприятия.
При первичном или уточняющем определении факторов (типов наночастиц), подлежащих периодическому контролю на предприятии наноиндустрии, в конкретной местности или локальной биосистеме рекомендуется проводить электронно-микроскопические исследования в рамках задач (1) - (5).
При определении степени опасности наночастиц, производящихся, используемых или образующихся в виде побочных продуктов на предприятиях наноиндустрии, выявлении их острых, хронических и отсроченных токсических эффектов рекомендуется проводить электронно-микроскопические исследования в рамках задач (1) - (8).
При проведении периодических контрольных мероприятий рекомендуется проводить электронно-микроскопические исследования в рамках задач (1) - (5).
Процедуры отбора проб тканей и органов животных, их фиксации, транспортировки и хранения отобранного материала регламентируются в соответствии с действующими нормативно-методическими документами.
При выборе вида растений для проведения контрольных мероприятий на предприятии наноиндустрии, в его окрестностях (на территории Российской Федерации) или для определения степени опасности наночастиц следует придерживаться следующих рекомендаций.
В качестве тест-систем для обнаружения наноматериалов в растениях рекомендуется выбирать дикорастущие виды: пырей (Agropyron L.), тимофеевка (Phleum L.) и др.; или культивируемые виды злаков: пшеница (Tritucum L.), ячмень (Hordeum L.), рожь (Secale L.), овес (Avena L.), рис (Oryza L.), растущие или выращиваемые вблизи производств, возможных источников загрязнений (наночастиц).
Выбор представителей семейства злаков (Poaceae) связан с их повсеместным распространением (дикие злаки - сорняки) и разведением в сельском хозяйстве (основные зерновые культуры). Весной вырастают не только проростки злаков (из осыпавшихся семян, находящихся в почве). Большинство сорных злаков - многолетние растения и они ежегодно отрастают от корневищ, зимующих в почве. Более того, озимые культурные хлебные злаки (растения целиком) зимуют под снегом. Для анализа подходят как проростки, так и взрослые растения (злаки), растущие вблизи очагов возможного загрязнения.Для определения содержания наноматериалов методом электронной микроскопии в растениях рекомендуется брать не менее 5 растений одного вида.
Пробоподготовка тканей животных и растений для проведения электронно-микроскопических исследований может выполняться без контрастирования или с применением контрастирующих агентов (таблицы 4, 5).
Препарирование без контрастирования можно использовать, если определяемые наночастицы обладают более высокой электронной плотностью (ВЭП-наночастицы), чем биологический материал (матрикс), в котором их требуется обнаружить и охарактеризовать. Препарирование без контрастирования является наилучшей и наиболее простой методикой для электронно-микроскопических исследований ВЭП-наночастиц в рамках задач (1)-(5), но оно не подходит для решения задач (6)-(8).
Если определяемые наночастицы обладают электронной плотностью сравнимой с электронной плотностью биологического материала, в котором их требуется выявлять (наночастицы с низкой электронной плотностью, НЭП-наночастицы), то препарирование следует выполнять с применением контрастирующих агентов. При этом для электронно-микроскопических исследований НЭП-наночастиц в рамках задач (1)-(5) необходимо подобрать те контрастирующие агенты и процедуры их использования, которые обеспечивают наилучшее распознавание определяемых наночастиц в биологическом материале.
Препарирование с применением контрастирующих агентов следует использовать для любых наночастиц при электронно-микроскопических исследованиях в рамках задач (6)-(8). При решении задач (6) и (7) применение агентов, делающих клеточные и тканевые структуры более контрастными и узнаваемыми, не должно мешать распознаванию наночастиц в этих структурах. При решении задачи (8) контрастирующие агенты и процедуры их применения выбираются так, чтобы обеспечить наиболее достоверный анализ наличия, характера и степени морфологических изменений в клеточных и тканевых структурах пусть даже и в ущерб возможности распознавания наночастиц в этих структурах. Все процедуры пробоподготовки проводятся только в стеклянной посуде.
Таблица 4.
Подготовка образцов для определения наночастиц методами ПЭМ в тканях животных
Вид исследуемого материала
| фрагменты тканей и органов животных
| Физическая форма исследуемого материала
| изолированные кусочки тканей и органов животных, фиксированные в 2, 5 % глутаровом альдегиде на 0, 1 М фосфатно-солевом буфере, рН 7, 2-7, 4 с добавлением 2% нейтрального формалина
| Количество материала для выполнения исследований
| по 4 кусочка каждого вида образцов (из одного органа или гистологически выделяемого типа ткани)
| Приборное обеспечение
| Электронный микроскоп по п.6.1.1.; дополнительное оборудование по п.6.2.4.
| Материалы
| Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой, автоматические пипетки вместимостью 1 см3 и 200 мм3, наконечники к автоматическим пипеткам, пипетки вместимостью 5 см3, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пенициллиновые флаконы вместимостью 10 см3, мерный цилиндр вместимостью 100 см3, стеклянные или алмазные ножи для ультрамикротома
| Химические реактивы
| хлорид натрия, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, четырехокись осмия (OsO4), 96 % этиловый спирт, 100 % ацетон, эпоксидные смолы (на основе эпона), катализатор полимеризации (тридиметиламинофенол), уранилацетат, цитрат свинца, деионизированная вода
| Процедура подготовки срезов тканей и органов животных для определения наноматериалов методами электронной микроскопии
| Подготовка реактивов и материалов к эксперименту
| – приготовление 0, 1 М фосфатно-солевого буфера (рН 7, 2-7, 4);
– приготовление 1 % раствора четырехокиси осмия на фосфатно-солевом буфере (рН 7, 2-7, 4);
– приготовление батареи водных растворов этанола возрастающей концентрацией (50%, 60%, 70%, 80%);
– приготовление заливочной эпоксидной смолы;
– приготовление смесей ацетона и эпоксидной смолы в объемных соотношениях 3: 1, 1: 1, 1: 3;
– приготовление раствора цитрата свинца;
– приготовление 2, 0 % раствора уранилацетата в 70% этаноле
| Подготовка исследуемых материалов к приготовлению ультратонких срезов для определения наноматериалов методами электронной микроскопии
| Образцы материала в фиксирующем растворе (2, 5 % раствор глутарового альдегида на 0, 1 М фосфатно-солевом буфере рН 7, 2-7, 4 с добавлением 2% нейтрального формалина) разделяют на две равные группы для проведения анализа в присутствии контрастирующих агентов и на неконтрастированных срезах.
| Приготовление ультратонких срезов образцов тканей и органов животных для определения наноматериалов методами электронной микроскопии в присутствии контрастирующих агентов
| – фиксирующий раствор отмывают 2 см3 0, 1 М фосфатно-солевого буфера (рН 7, 2–7, 4); процедуру повторяют всего 3 раза;
– пробу материала дополнительно фиксируют в 2 см3 1, 0 % раствора четырехокиси осмия на 0, 1 М фосфатно-солевом буфере (рН 7, 2-7, 4) в течение 2 ч при комнатной температуре;
– образец обрабатывают 2 см3 водного 50 % раствора этанола в течение 20 мин при 4 °С; процедуру повторяют до получения визуально прозрачного водно-спиртового смыва;
– образец обрабатывают 2 см3 водного 60 % раствором этанола в течение 20 мин при 4 °С;
– образец повторно обрабатывают 2 см3 водного 60 % раствором этанола в течение 20 мин при 4 °С;
– образец обрабатывают 2 см3 1 % раствора уранилацетата в 70 % этаноле в течение 12 ч при 4 °С (оставляют на ночь в холодильнике);
- образец обрабатывают 2 см3 80 % водного раствора этанола в течение 20 мин при комнатной температуре;
- образец обрабатывают 2 см3 96 % водного раствора этанола в течение 20 мин при комнатной температуре;
- образец обрабатывают 100 % ацетоном 3 раза по 45 мин при комнатной температуре;
– образец пропитывают в трех сменах ацетона и эпоксидной смолы с восходящей концентрацией смолы (1: 3, 1: 1, 3: 1 по объемному соотношению смолы и ацетона); время пропитки составляет 2 ч для смесей 1: 3 и 1: 1 и 12 ч для смеси 3: 1 при комнатной температуре;
– образец помещают в эпоксидную смолу на 2 ч для пропитки;
– образец помещают в заливочную форму, заполненную эпоксидной смолой с добавлением катализатора, и полимеризуют в течение 24 ч при температуре 37 º С, а затем в течение 48 ч при температуре 60 º С;
– на ультрамикротоме стеклянным или алмазным ножом из полимеризованного эпоксидного блока в зоне, содержащей образец, получают ультратонкие срезы толщиной 30, 0-60, 0 нм;
– ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой;
– ультратонкие срезы окрашивают цитратом свинца и 1, 0 % раствором уранилацетата
| Приготовление ультратонких срезов образцов тканей и органов животных для определения наноматериалов методами электронной микроскопии без контрастирования
| – фиксирующий раствор отмывают 2 см3, 1 М фосфатно-солевого буфера (рН 7, 2–7, 4); процедуру повторяют всего 3 раза;
– образец обрабатывают 2 см3 водного 50 % раствора этанола в течение 20 мин при 4 °С; процедуру повторяют до получения визуально прозрачного водно-спиртового смыва;
– образец обрабатывают 2 см3 водного 60 % раствором этанола в течение 20 мин при 4 °С;
– образец повторно обрабатывают 2 см3 водного 60 % раствором этанола в течение 20 мин при 4 °С;
– образец обрабатывают 2 см3 водного 70 % раствора этанола в течение 12 ч при 4 °С (оставляют на ночь в холодильнике);
- образец обрабатывают 2 см3 80 % водного раствора этанола в течение 20 мин при комнатной температуре;
- образец обрабатывают 2 см3 96 % водного раствора этанола в течение 20 мин при комнатной температуре;
- образец обрабатывают 100 % ацетоном 3 раза по 45 мин при комнатной температуре;
– образец пропитывают в трех сменах ацетона и эпоксидной смолы с восходящей концентрацией смолы (1: 3, 1: 1, 3: 1 по объемному соотношению смолы и ацетона); время пропитки составляет 2 ч для смесей 1: 3 и 1: 1 и 12 ч для смеси 3: 1 при комнатной температуре;
– образец помещают в эпоксидную смолу на 2 ч для пропитки;
– образец помещают в заливочную форму, заполненную эпоксидной смолой с добавлением катализатора, и полимеризуют в течение 24 ч при температуре 37 º С, а затем в течение 48 ч при температуре 60 º С;
– на ультрамикротоме стеклянным или алмазным ножом из полимеризованного эпоксидного блока в зоне, содержащей образец, получают ультратонкие срезы толщиной 30, 0-60, 0 нм;
– ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой
| Таблица 5.
Подготовка образцов для определения наночастиц методами ПЭМ в тканях и органах растений
Вид исследуемого материала
| фрагменты тканей и органов растений (корешков и листьев)
| Физическая форма исследуемого материала
| изолированные кусочки тканей и органов растений, фиксированные в 2, 5 % глутаровом альдегиде на 0, 1 М буфере Зоренсена, рН 7, 2-7, 4, с добавлением 15 г/л сахарозы
| Количество материала для выполнения исследований
| по 2 кусочка каждого вида образцов (из одного органа или гистологически выделяемого типа ткани)
| Приборное обеспечение
| Термостат, холодильник, вытяжной шкаф, рН-метр, электромешалка, ультрамикротом
| Материалы
| Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой, автоматические пипетки вместимостью 1 см3 и 200 мм3, наконечники к автоматическим пипеткам, пипетки вместимостью 5 см3, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3 пенициллиновые флаконы вместимостью 10 см3, мерный цилиндр вместимостью 100 см3, стеклянные или алмазные ножи для ультрамикротома
| Химические реактивы
| натрий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, сахароза, 96 % этиловый спирт, 100 % ацетон, эпоксидные смолы (на основе эпона), катализатор полимеризации (тридиметиламинофенол), деионизированная вода
| Процедура подготовки срезов тканей и органов растений для определения наноматериалов методами электронной микроскопии
| Подготовка реактивов и материалов к эксперименту
| – приготовление 0, 1 М буфера Зоренсена (рН 7, 2-7, 4) с добавлением 15 г/л сахарозы;
– приготовление батареи водных растворов этанола возрастающей концентрацией (20 %, 30 %, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%);
– приготовление заливочной эпоксидной смолы;
– приготовление смесей ацетона и эпоксидной смолы в объемных соотношениях 3: 1, 1: 1, 1: 3
| Приготовление ультратонких срезов образцов тканей и органов растений для определения наноматериалов методами электронной микроскопии (без контрастирования)
| – фиксирующий раствор отмывают 2 см3, 1 М буфера Зоренсена (рН 7, 2–7, 4) с добавлением 15 г/л сахарозы; процедуру повторяют всего 3 раза;
– образец дегидратируют, инкубируя в водных растворах этанола возрастающей концентрации (20 %, 30 %, 40 %, 50%, 60%) в течение 30 мин при комнатной температуре;
– образец инкубируют в 70 % растворе этанола в течение 12 ч при комнатной температуре;
- образец инкубируют в 80 % растворе этанола в течение 30 мин при комнатной температуре;
- образец инкубируют в 96 % растворе этанола в течение 30 мин при комнатной температуре;
- образец обрабатывают 100 % ацетоном 2 раза по 60 мин при комнатной температуре;
– образец пропитывают в трех сменах ацетона и эпоксидной смолы с восходящей концентрацией смолы (1: 3, 1: 1, 3: 1 по объемному соотношению смолы и ацетона); время пропитки составляет 24 ч для смеси каждого состава при комнатной температуре;
– образец помещают в заливочную форму, заполненную эпоксидной смолой с добавлением катализатора, и полимеризуют в течение 24 ч при температуре 37 º С, затем в течение 24 ч при температуре 45 º С, затем в течение 24 ч при температуре 60 º С;
– на ультрамикротоме стеклянным или алмазным ножом из полимеризованного эпоксидного блока в зоне, содержащей образец, получают ультратонкие срезы толщиной 30, 0-60, 0 нм;
– ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические бленды, покрытые формваровой пленкой
|
Выявление и определение характеристик наночастиц в биологических образцах проводится в порядке, изложенном в таблице 6.
Таблица 6
Определение наночастиц в ультратонких срезах клеток, тканей и органов животных и растений методами просвечивающей электронной микроскопии
|