Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в сточных и грунтовых водах методом негативно-окрашенных препаратов
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах представлена в таблице 8.
Таблица 8.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в сточных и грунтовых водах методом негативно окрашенных препаратов.
| Объект исследования
| Грунтовые и сточные воды
| | Физическая форма
| Жидкость (суспензия воды, содержащая органические и неорганические примеси)
| | Количество материала для выполнения исследований
| 10-20 см3 фильтрата сточной (грунтовой) воды, полученного после медленного выпаривания 1-2 л фильтрата сточной воды
| | Приборное обеспечение
| Пробоотборник воды, роторный вакуумный насос или водоструйный насос, водяная баня, электронный микроскоп по п.6.1.1.
| | Материалы
| Круглодонные колбы вместимостью 2 или 3 л со шлифом, обеззоленные фильтры, пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10× 20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки
| | Химические реактивы
| Формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, дистиллированная вода
| | Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе
| Этап 1 (подготовка реактивов и материалов к эксперименту):
– приготовление 0, 15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0, 5 % раствора коллодия на амилацетате;
– покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой;
– приготовление 1, 0 % раствора уранилацетата.
Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии):
– пробы сточной (грунтовой) воды фильтруют через 5-6 слоев обеззоленных фильтров, фильтрат выливают в химически чистые колбы, соединенные с роторным вакуумным насосом или водоструйным насосом, фильтрат выпаривают на водяной бане при температуре 80-90 º С до уменьшения первоначального объема в 1000-2000 раз.
– пробы концентрированного фильтрата выпариванием наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой (коллодиевой) пленкой;
– при необходимости сеточки контрастируют 1, 0 % раствором уранилацетата
| | Исследование проб воды в просвечивающем электронном микроскопе
| Согласно п.6.3.
| | Анализ электронно-микроскопических изображений
структуры наноматериала (продукта) в пробах воды
| Основные этапы:
– визуализация наночастиц в структуре воды;
– морфометрический анализ наночастиц;
– определение степени полиморфизма наночастиц в воде;
– определение степени агрегированности наночастиц в воде
| | Основные параметры и характеристики наноматериала в сточных (грунтовых) водах для выдачи заключения
| Структурные и морфометрические характеристики наноматериала:
– наличие частиц размерами 1, 0-100, 0 нм в образце;
– уровень электронно-оптической плотности частиц;
– форма частиц;
– коэффициент формы наночастиц;
– степень полиморфизма наночастиц в воде;
– степень агрегированности наночастиц в воде;
– характер распределения наночастиц в воде
|
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в пробах сточных (грунтовых) вод содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемых пробах воды, данные о степени агрегированности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в образцах, электронно-микроскопические изображения частиц в воде.
6.4.6.2. Электронно-микроскопическая визуализация и идентификация наночастиц в сточных и грунтовых водах методом ультратонких срезов
Схема проведения экспериментов электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в твердой фракции сточных и грунтовых вод представлена в таблице 9.
Таблица 9.
Схема проведения экспериментов по электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц твердой фракции сточных и грунтовых вод
| Вид исследуемого материала
| Твердая фракция сточных и грунтовых вод или осадок
| | Физическая форма исследуемого материала
| Осадок (влажная биомасса гидробионтов и микроорганизмов)
| | Количество материала для выполнения исследований
| 100-150 мг влажной биомассы биопленки
| | Приборное обеспечение
| Электронный микроскоп по п.6.1.1.; дополнительное оборудование по п.6.2.4.
| | Материалы
| Пинцет для электронно-микроскопических работ, электронно-микроскопические сеточки, пластинка тефлона размером 10× 20 см, микропипетка вместимостью 50 мм3, наконечники к микропипетке, колбы вместимостью 100 см3, пробирки вместимостью 20 см3, пипетки
| | Химические реактивы
| Глутаровый альдегид, четырехокись осмия, какодилат натрия, этиловый спирт, абсолютный этиловый спирт или 100, 0 % ацетон, эпоксидные смолы (аралдит или эпон), формвар, коллодий, амилацетат, дихлорэтан, уранилацетат, цитрат свинца, дистиллированная вода
| | Препарирование образцов для исследования в электронном микроскопе
| Этап 1(подготовка реактивов и материалов к эксперименту):
– приготовление 4, 0 % раствора глутарового альдегида на 0, 01 моль какодилатном буфере (рН 7, 2);
– прготовление 2, 0 % раствора четырехокиси осмия на 0, 01 моль какодилатном буфере (рН 7, 2);
– приготовление батареи спиртов возрастающей концентрацией;
– приготовление смеси абсолютного спирта и эпоксидной смолы (аралдита);
– заливочная эпоксидная смола;
– приготовление 0, 15 % раствора формвара на дихлорэтане или 0, 5 % раствора коллодия на амилацетате;
–покрытие электронно-микроскопических сеточек формваровой (коллодиевой) пленкой;
– приготовление 1, 0 % раствора уранилацетата; приготовление раствора цитрата свинца; приготовление эпоксидной смолы
Этап 2 (препарирование образцов для электронной микроскопии):
– пробы осадка фиксируют и инактивируют в 4, 0 % растворе глутарового альдегида на 0, 01 моль какодилатном буфере (рН 7, 2);
– образцы дофиксируют в 2, 0 % растворе четырехокиси осмия на 0, 01 моль какодилатном буфере (рН 7, 2);
– образцы дегидратируют в нескольких сменах этилового спирта с возрастающей концентрацией, образцы выдерживают в трех сменах абсолютного этилового спирта или ацетона;
– образцы пропитывают в трех сменах абсолютного этилового спирта и аралдита;
– образцы заключают в аралдит и полимеризуют в течение 72 час при температуре 60 º С;
– на ультрамикротоме стеклянным ножом из образцов осадка сточных (грунтовых) вод получают ультратонкие срезы толщиной 30, 0-60, 0 нм;
– ультратонкие срезы монтируют на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой пленкой;
– ультратонкие срезы наноматериала окрашивают цитратом свинца и 1, 0 % раствором уранилацетата
| | Исследование ультраструктуры осадка сточных (грунтовых) вод в просвечивающем электронном микроскопе
| Согласно п.6.3.
| | Анализ электронно-микроскопических изображений
ультраструктуры осадка сточных (грунтовых) вод, содержащего наноматериалы
| Основные этапы:
– визуализация наночастиц на ультратонких срезах осадка сточных (грунтовых) вод;
– морфометрический анализ наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод и клеток гидробионтов, микроорганизмов;
– определение степени полиморфизма наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод и клеток микроорганизмов;
– оценка степени загруженности гидробионтов и микробов наночастицами (число наночастиц на одну клетку);
– диагностика структурных патологий в микробах;
– определение числа микробов в осадке с летальными повреждениями и др.
| | Основные параметры и характеристики наночастиц (наноматериала) в структуре осадка сточных (грунтовых) вод для выдачи заключения
| Структурные и морфометрические характеристики наноматериала:
– наличие частиц размерами 1, 0-100, 0 нм в осадке сточных (грунтовых) вод;
– уровень электронно-оптической плотности наночастиц;
– форма наночастиц;
– коэффициент формы наночастиц;
– степень полиморфизма наночастиц в материале;
– степень агрегированности наночастиц в образце;
– степень загруженности микробов наночастицами;
– характер повреждений ультраструктуры микробов наночастицами;
–количество микробов в осадке с интактной ультраструктурой;
– число микробов в осадке с летальными повреждениями и др.
|
Результаты и заключение электронно-микроскопической визуализации и идентификации наночастиц в структуре осадка сточных (грунтовых) вод содержат информацию о форме, структуре и размерах наночастиц в исследуемом материале, данные о степени агрегировнности наночастиц, сведения о характере распределения наночастиц в образцах, число частиц на один микроб, характер и степень повреждения микроорганизмов наночастицами, электронно-микроскопические изображения наночастиц, осадка и микробов.
|
