Тема: Перекисное окисление липидов в норме и патологии. Ферментативное звено антиоксидантной системы защиты.

Биохимия обмена веществ

I Научно-методическое обоснование темы:

Активные формы кислорода – классификация и свойства.

Кислород, необходимый организму для функционирования ЦПЭ и многих других реакций, является одновременно и токсическим веществом, если из него образуются так называемые активные формы.

К активным формам кислорода относят:
ОН^• - гидроксильный радикал;
- супероксидный анион;
Н₂О₂ - пероксид водорода.

А так же пергидроксильный (НО2∙ ), пероксильный (RO2∙ ) и алкоксильный (RO∙ ) радикалы, оксид азота (NO∙ ), пероксинитрит (ONOO-), гипохлорит (HOCl), перекись водорода (H2O2) и др. Помимо продуктов восстановления О2, к АФК относят также озон (О3) и синглетный кислород 1О2, то есть кислород, находящийся в возбужденном (синглетном) состоянии [Владимиров, 1998; Осипов, Азизова, Владимиров, 2003].

Активные формы кислорода образуются во многих клетках в результате последовательного одноэлектронного присоединения 4 электронов к 1 молекуле кислорода. Конечный продукт этих реакций - вода, но по ходу реакций образуются химически активные формы кислорода. Наиболее активен гидроксильный радикал, взаимодействующий с большинством органических молекул. Он отнимает от них электрон и инициирует таким образом цепные реакции окисления. Эти свободнорадикальные реакции окисления могут выполнять полезные функции, например, когда клетки белой крови с участием активных форм кислорода разрушают фагоцитированные клетки бактерий. Но в остальных клетках свободнорадикальное окисление приводит к разрушению органических молекул, в первую очередь липидов, и, соответственно, мембранных структур клеток, что часто заканчивается их гибелью. Поэтому в организме функционирует эффективная система ингибирования перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Источники активных форм кислорода

ЦПЭ как источник активных форм кислорода

Утечка электронов из ЦПЭ и непосредственное их взаимодействие с кислородом - основной путь образования активных форм кислорода в большинстве клеток.

Кофермент Q в ЦПЭ принимает от доноров последовательно по одному электрону, превращаясь в форму семихинона (рис. 8-55) - KoQH^• (см. раздел 6).

Этот радикал может непосредственно взаимодействовать с кислородом, образуя супероксидный анион , который, в свою очередь, может превращаться в другие активные формы кислорода:

Рис. 1. Реакции последовательного восстановления убихинона вдыхательной цепи.

Многие оксидазы - ферменты, непосредственно восстанавливающие кислород, образуют пероксид водорода - Н₂О₂. Оксидазы образуют пероксид водорода по схеме:

О₂ + SH₂ → S + Н₂О₂,

где SH₂ - окисляемый субстрат.

Примеры таких оксидаз - оксидазы аминокислот, супероксид дисмугаза, оксидазы, локализованные в пероксисомах. Оксидазы пероксидом окисляют, в частности, жирные кислоты с очень длинной углеродной цепью (более 20 углеродных атомов) до более коротких, которые далее подвергаются β -окислению в митохондриях.

Монооксигеназы, например цитохром Р₄₅₀, включающий один атом кислорода в окисляемую молекулу, и диоксигеназы, включающие оба атома кислорода, также служат источниками активных форм кислорода.

Пероксид водорода химически не очень активен, но способствует образованию наиболее токсичной формы кислорода - гидроксильного радикала (ОН^•) по следующей реакции:

Fe²⁺ + Н₂О₂ → Fe³⁺ + ОН^- + ОН^•.

Наличие в клетках Fe²⁺ или ионов других переходных металлов увеличивает скорость образования гидроксильных радикалов и других активных форм кислорода. Например, в эритроцитах окисление иона железа гемоглобина способствует образованию супероксидного аниона.

Супероксидный анион-радикал (О₂^-). Среди кислородных свободных радикалов ему отводят наиболее значительную роль, так как считается, что именно он является родоначальником многих других активных форм кислорода. Супероксидный радикал (СОР) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии [Chen, Warden, Stenken, 2004]. Химическая активность О₂^-в значительной степени зависит от физико-химического состояния окружающей его клеточной или внеклеточной среды. В водных растворах О₂^-способен окислять аскорбиновую кислоту, адреналин и тиоловые соединения, выступая как слабый окислитель [Хавинсон, Баринов, Арутюнян 2003]. Значительно более выражены восстановительные свойства супероксидного радикала. В присутствии ионов негемового железа СОР достаточно активно восстанавливает его из 3+ в 2+. Это свойство СОР чрезвычайно важно, поскольку двухвалентное железо играет большую роль в образовании агрессивных липидных и гидроксильных радикалов. Супероксидный радикал также может восстанавливать содержащие трехвалентное железо комплексы (цитохром с, ферри-ЭДТА) и нитросиний тетразолий.

Супероксиданион-радикал – пусковое звено каскада радикальных реакций, приводящих к возникновению большинства АФК и продуктов перекисного окисления липидов. Он участвует в синтезе хемотаксических пептидов, усиливает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов, ингибирует действие эндотелиального фактора расслабления, может повреждать мембраны эритроцитов, ингибировать Са-АТФазу, синтез РНК и белка эндотелиальных клеток, окислять белки сыворотки, в тоже время его непосредственная цитотоксичность невелика.

Неспецифическая АОС

Функция: предотвратить условия в процессе аутоокисленисубстратов (микросомальное окисление).

Ферментативное звено АОС

К ферментам, защищающим клетки от действия активных форм кислорода, относят супероксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу; Наиболее активны эти ферменты в печени, надпочечниках и почках, где содержание митохондрий, цитохрома Р₄₅₀ и пероксисом особенно велико.

СОД - это ключевой водорастворимый фермент. Превращает супероксидные анионы в пероксид водорода: 2 + 2H⁺ → H₂O₂ + O₂ интка, железа и имидазол гистидина. Локализуется в цитоплазме. Обладает высокой термоустойчивостью, устойчив к действию протеаз, обладает широким оптимумом рН каталитической активности.

Изоферменты СОД находятся и в цитозоле и в митохондриях и являются как бы первой линией защиты, потому что супероксидный анион образуется обычно первым из активных форм кислорода при утечке электронов из дыхательной цепи.

СОД - индуцируемый фермент, т.е. синтез его увеличивается, если в клетках активируется перекисное окисление. Пероксид водорода, который может инициировать образование самой активной формы ОН•, разрушается ферментом каталазой: 2Н₂О₂ → 2 Н₂О + О₂.

Каталаза (КАТ) находится в основном в пероксисомах, где образуется наибольшее количество пероксида водорода, а также в лейкоцитах, где она защищает клетки от последствий " респираторного взрыва".

КАТ обеспечивает расщепление перекисси водорода до двух молекул воды и кислорода. Из-за большго молекулярного веса практичеки не проникает через мембрану клетки.

Рис.2. Антиоксиданты водной фазы

Глутатионпероксидаза (ГПО) - важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию АФК, так как он разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов. Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (γ -глутамилцистеинилглицин). Сульфгидрильная группа глутатиона (GSH) служит донором электронов и, окисляясь, образует дисульфидную форму глутатиона, в которой 2 молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу.

Н₂О₂ + 2 GSH → 2 Н₂О + G-S-S-G.

Окисленный глутатион восстанавливается глутатионредуктазой:

GS-SG + NADPH + Н⁺ → 2 GSH + NADP⁺.

Глутатионпероксидаза, которая восстанавливает гидропероксиды липидов в составе мембран, в качестве кофермента использует селен (необходимый микроэлемент пищи). При его недостатке активность антиоксидантной защиты снижается.

ГПО является главной ферментативной системой плазмы крови: внеклеточных жидкостей и гидроперекисей липидов (ГПО 4), которая будучи липофильным соединением эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфотидилхолина, холестерина и эфиров холестерина в липопротеинах низкой плотности (ЛПНП), восстанавливая их, следовательно, защищая от окислительной модификации. Кроме того ГПО 4 совместно с токоферолом практически полностью подавляет ПОЛ в биологических мембранах благодаря тому, что витамин Е эффективно восстанавливает пероксирадикалы, а фермент разлагает гидроперекиси, препятствуя тем самым их вовлечению в окислительный цикл.

Глутатионтрансфераза (ГТ)

ГТ, в отличие от селенсодержащей ГПО, для которой лучшими субстратами являются гидрофильные гидроперекиси с малым размером молекул, эффективно восстанавливает гидрофобные гидроперекиси с большим объемом молекулы: гидроперекиси полиненасыщенных жирных кислот (линолевой и арахидоновой), фосфолипидов.

Вместе с тем во всех водных и липидных фазах организма могут протекать радикальные окислительные процессы, в защите от которых важную роль играют антиоксиданты-ингибиторы органических радикалов, среди которых важное место занимают соединения фенольного типа.

В настоящее время выделено несколько тысяч фенольных соединений, среди которых выраженным антиоксидантным эффектом обладают витамины Е и К, убихиноны, триптофан и фенилаланин, а так же большинство растительных (флавоноиды) и животных пигментов.

Неферментативнгое звено АОС

Витамин Е (α -токоферол) - наиболее распространённый антиоксидант в природе - является липофильной молекулой, способной инактивировать свободные радикалы непосредственно в гидрофобном слое мембран и таким образом предотвращать развитие цепи перекисного окисления. Различают 8 типов токоферолов, но α -токоферол наиболее активен.

Витамин Е отдаёт атом водорода свободному радикалу пероксида липида (ROO•), восстанавливая его до гидропероксида (ROOH) и таким образом останавливает развитие ПО. Свободный радикал витамина Е, образовавшийся в результате реакции, стабилен и не способен участвовать в развитии цепи. Наоборот, радикал витамина Е непосредственно взаимодействует с радикалами липидных перекисей, восстанавливая их, а сам превращается в стабильную окисленную форму -- токоферолхинон.

В антирадикальной защите липопротеинов плазмы крови и клеточных мембран α -токоферолу принадлежит ведущая роль – одна его молекула защищает ≈ 10000 молекул ненасыщенных жирных кислот, при этом считается, что α -токоферол способен обезвредить не менее 60% образующихся пероксильных радикалов. Окисление α -токоферола со свободными радикалами компенсируется биорегенерацией молекул этого антиоксиданта в реакциях восстановления коантиоксидантами (АН), редокс-потенциал которых ниже, чем у радикала α -токоферола (α -Тф-О.). В результате такой реакции не только происходит восстановление витамина Е, но и предотвращается возможность инициации α -токофероксильным радикалом окисления липидов:

α -Тф-О. + RH→ α -Тф-ОH + R. (1)

α -Тф-О. + АH→ α -Тф-ОH + А. (2)

В физиологических условиях вторая реакция обычно превалирует над первой, так как константа скорости реакции α -Тф-О. с НЖК не превышает 103М-1с-1, в то время как для реакции (1) константа скорости может достигать значений 104-107М-1с-1.К наиболее изученным коантиоксидантам относятся убихинол, аскорбиновая кислота (АК), билирубин.

Витамин Е (а-токоферол) ингибирует свободнорадикальное окисление путём отдачи электрона, что приводит к инактивации радикала липида, а витамин Е превращается в стабильный, полностью окисленный токоферолхинон.

Рис. 3. Механизм антиоксидантного действия витамина Е.

Рис.4. Окислительно-восстановителные превращения α -токоферола и сопряженных с ним коантиоксидантов.

Витамин С (Рис.5.) (аскорбиновая кислота) также является антиоксидантом и участвует с помощью двух различных механизмов в ингибировании ПОЛ. Во-первых, витамин С восстанавливает окисленную форму витамина Е и таким образом поддерживает необходимую концентрацию этого антиоксиданта непосредственно в мембранах клеток. Во-вторых, витамин С, будучи водорастворимым витамином и сильным восстановителем, взаимодействует с водорастворимыми активными формами кислорода - , Н₂О₂, ОН• и инактивирует их.

β -Каротин, предшественник витамина А (рис.6.), также обладает антиоксидантаьш действием и ингибирует ПОЛ. Показано, что растительная диета, обогащённая витаминами Е, С, кароти-ноидами, существенно уменьшает риск развития атеросклероза и заболеваний ССС, подавляет развитие катаракты - помутнения хрусталика глаза, обладает антиканцерогенным действием. Имеется много доказательств в пользу того, что положительное действие этих компонентов пищи связано с ингибированием ПОЛ и других молекул и, следовательно, с поддержанием нормальной структуры компонентов клеток.

Рис.5. Витамин С.

Рис. 6. Витамин А

АК превосходит другие антиоксиданты плазмы в защите липидов от перекисного окисления, так как только это соединение достаточно реакционноспособно, чтобы эффективно ингибировать инициацию ПОЛ в водной фазе.

Важными внеклеточными антиокислителями являются альбумины – простые гидрофильные белки плазмы крови, которые являются основными носителями SН групп. SН содержащим соединениям принадлежит ведущая роль в защите клеток от ОН-радикала, образующегося в реакции Фентона или в результате разложения молекул воды под действием ионизирующих излучений.

Необходимо отметить наличие антирадикальных свойств у белков, хелатирующих ионы железа и других металлов с переменой валентностью. В первую очередь это трансферрин, лактоферрин и церулоплазмин. Основная роль трансферрина и близкого ему по структуре лактоферрина, содержащегося в молоке и выделяющегося фагоцитами при их активации, состоит в акцептировании «свободного» железа, что препятствует образованию радикалов НО, в реакциях Фентона, катализируемых ионами Fe. Значимую роль в этом процессе играет церулоплазмин, Cu-содержащий белок, обеспечивающий окисление Fe 2+ до Fe3+ и делающий тем самым железо доступным для связывания трансферрина.

Наиважнейшим антиоксидантом внеклеточной жидкости является мочевая кислота (МК). Ввиду высокого ее содержания в плазме крови человека некоторые исследователи считают, что на нее приходится 35-65% защиты липопротеинов от окисления, 10-15% ингибирования НО. и 12% ингибирования синглетного кислорода. Кроме того МК может выступать синергистом с радикалами α -токоферола и аскорбиновой кислотой, что усиливает их антиоксидантное действие.

В последние годы широко обсуждается роль активных форм кислорода (АФК) и инициируемых ими свободнорадикальных процессов при различных патологических процессах. В нормальных условиях активность этих процессов находится на невысоком уровне, но при стрессовых ситуациях происходит усиленное образование АФК, под действием которых происходит избыточная и неконтролируемая активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что в конечном итоге может привести к патологическому состоянию, которое сопровождается дисбалансом ферментативных и неферментативных компонентов системы антиоксидантной защиты. Характерным проявлением окислительного стресса является интенсификация процессов перекисного окисления липидов, индикатором которой служит увеличение содержания хотя бы одного из его продуктов. Данные о содержании продуктов ПОЛ в биологических объектах могут нести в себе информацию о глубине и степени патологического процесса. В качестве количественных маркеров наиболее часто используются такие интермедиаты ПОЛ, как диеновые конъюгаты (ДК), а также один из его конечных продуктов – малоновый диальдегид (МДА).

II Цель деятельности студентов на занятии

Студент должен знать:

1. АФК. Каким действием они обладают;

2. Источники образования АФК;

3. ПОЛ в норме;

4. ПОЛ при патологии;

5. Стадии ПОЛ;

6. АОС, классификация, функции;

7. Ферментативное звено АОС;

8. Описать действие СОД, характеристики;

9. КАТ. Механизм действия;

10. ГПО и ГП. Механизм действия;

11. Неферментативное звено АОС;

12. Роль ионов меди, цинка, железа и других металлов в АОС;

13. «Окислительный стресс»;

Студент должен уметь:

1. Уметь писать реакцию, катализируемую СОД;

2. Уметь писать реакцию, катализируемую КАТ;

3. Уметь писать реакцию, катализируемую ГПО;

4. Написать стадии ПОЛ;

5. Роль витамина Е в стрессовой ситуации.

IIIСодержание обучения:

Основные вопросы:

1. АФК. Механизм действия;

2. Источники АФК в организме;

3. ПОЛ в норме;

4. Особенности ПОЛ в условиях патологии;

5. Стадии ПОЛ;

6. АОС, классификация, функции;

7. Ферментативное звено АОС;

8. Характеристики СОД. Механизм действия;

9. КАТ. Механизм действия;

10. ГПО и ГП. Механизм действия;

11. Неферментативное звено АОС;

12. Роль витамина Е в стрессовой ситуации.

13. Роль витамина А, К в защите клеток от действия АФК;

14. Роль ионов меди, цинка, железа и других металлов в АОС;

15. «Окислительный стресс».

ЛАБОРАТОНАЯ РАБОТА №1

ЛАБОРАТОНАЯ РАБОТА №2

Количественное определение каталазы в крови.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

В основе количественного определения активности каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени. О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества перманганата калия. израсходованного на титрование перекиси водорода до и после действия каталазы.

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом называют количество мг перекиси водорода, которое разлагается под действием 1 мкл крови.

ХОД РАБОТЫ.

Работу проводят по следующей схеме:

Р е а к т и в ы	Стаканчик № 1 (опыт)	Стаканчик № 2 (контроль)
Кровь	1 мл	1 мл
Вода дистиллированная	7 мл	7 мл
Перекись водорода 1%	2 мл	-
Серная кислота 10%	-	5 мл
Стаканчики оставляют на 30 мин при комн. t, изредка встряхивая Через 30 мин
Перекись водорода 1%	-	2 мл
Серная кислота 10 %	5 мл	-

Действие каталазы в кислой среде прекращается, т. к. этот фермент действует при рН=7, 4. Поскольку в контрольную пробу серную кислоту приливали до добавления перекиси водорода, то в контроле все добавленное количество перекиси водорода остается нерасщепленным.

Содержимое каждого стаканчика необходимо титровать раствором перманганата калия до розового окрашивания, не исчезающего в течение 30 сек.

Рассчитать каталазное число (КЧ) по формуле:

КЧ = (А - В) х 1, 7,

где:

А - кол-во 0, 1 N раствора КМnО4, пошедшее на титрование контрольной пробы в мл.

В - кол-во 0, 1N раствора КМnО4, пошедшее на титрование опытной пробы в мл.

1, 7 - это коэффициент, показывающий, сколько мг Н2О2содержится в 1мл 0, 1н. раствора Н₂О₂.

В норме каталазное число колеблется от 10 до 15 единиц у взрослых и 7, 5 - 9, 9 единиц у детей.

РАСЧЕТ И ВЫВОДЫ:

Самостоятельная работа: составление тестов и кроссворда по теме ПОЛ.

Тестовый контроль:

Тема: ПОЛ.

1. К активным формам кислорода относят:

1. ОН- - гидроксильный радикал;

2. супероксидный анион;

3. Н2О2 - пероксид водорода

4. все перечисленное

Отв.: 4

2. Образование активных форм кислорода происходит:

1. в процессе переноса электронов в митохондриальной дыхательной цепи;

2. в реакциях, которые катализируются оксидазами (образуется перекись водорода), в том числе в свободнорадикальных процессах, совершающихся в фагоцитах;

3. в реакциях микросомального окисления при обезвреживании веществ с участием цитохрома Р-450;

4. в реакциях самопроизвольного (неферментативного) окисления веществ (гемоглобина, ферредоксинов, адреналина и др.);

5. в биологических системах с наличием ионов металлов с переменной валентностью и, прежде всего, железа (свободных атомов, так называемых внегемовых);

6. верно все

Отв.: 6

3. Перечислите ряд причин вызывающих активацию ПОЛ в тканях:

1. снижение поступления в организм алиментарных антиоксидантов (АО), таких как: токоферол, аскорбат, биофлавоноиды и др.;

2. стресс различного генеза, в частности эмоциональный (под влиянием катехоламинов и кортикостероидов в кровь поступает избыток жирных кислот и кислород);

3. внешние химические прооксиданты (пестициды, лекарственные окислители, алкоголь, продукты смога и т.д.);

4. физические факторы (повышенный радиоактивный фон, ультрафиолетовое облучение, электромагнитное поле, ультразвук с интенсивностью выше 2 Вт/см );

5. избыточное и несбалансированное потребление жиров и углеводов на фоне недостаточного их расходования;

6. гипокинезия с низким уровнем биологического окисления ферментов, т.е. сниженный уровень восстановления пиридиннуклеотидов;

7. врожденные энзимопатии антиоксидантных ферментов (каталазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы);

8. падение с возрастом активности антиоксидантных ферментов.

9. верного ответа нет

10. верно все перечисленное

Отв.: 10

4. Антиоксиданты нужны для…, исключите неправильный ответ:

1. обновления липидного состава мембран;

2. синтеза эйкозаноидов

3. обезвреживания ксенобиотиков и токсичных продуктов метаболизма;

4. функционирования иммунной системы.

5. синтеза глюкогона

Отв.: 1, 2, 4, 5

5. Оксидативный стресс приводит:

1. Повреждение ДНК, белков, липидов мембран.

2. Канцерогенез, нейродегенеративные болезни, атеросклероз, сахарный диабет, сердечно сосудистые заболевания, старение.

3. 1, 2

Отв.: 1, 2

6. Этот витамин ингибирует свободнорадикальное окисление путём отдачи электрона, что приводит к инактивации радикала липида и превращается в стабильный, полностью окисленный токоферолхинон:

1. В1

2. РР

3. Е

4. С

5. Д

Отв.: 3

7. Вит. A:

1. увеличивает антиоксидантное действие Вит. Е; Вместе с Вит. E и Вит. С;

2. активирует включение Se в состав глутатионпероксидазы;

3. препятствует окислению SH-групп белков и пептидов.

4. может быть прооксидантом

5. все верно

Отв. 5

7. Структура, какого витамина представлена ниже:

1. А; 2. Д; 3. Е; 4. РР; 5. К

Отв.: 1

9. Этот витамин активирует ПОЛ так как является полиненасыщенным спиртом и легко окисляется кислородом может быть прооксидантом (в высоких дозах):

1. К:

2. А;

3. Д;

4. Е;

5. РР

Отв.: 2

Рис. 1. Реакции последовательного восстановления убихинона вдыхательной цепи.

Рис.2. Антиоксиданты водной фазы

Рис. 3. Механизм антиоксидантного действия витамина Е.

Рис.4. Окислительно-восстановителные превращения α -токоферола и сопряженных с ним коантиоксидантов.

Рис.5. Витамин С.

Рис. 6. Витамин А

Рис. 7. Повреждающее действие свободных радикалов на компоненты клетки. 1 - разрушение белков; 2 - повреждение ЭР; 3 - разрушение ядерной мембраны и повреждение ДНК; 4 - разрушение мембран митохондрий; 5 - ПОЛ клеточной мембраны; 6, 7, 8 - проникновение в клетку воды и ионов.

Рис. 8. Образование супероксида в ЦПЭ. " Утечка" электронов в ЦПЭ может происходить при переносе электронов с участием коэнзима Q. При восстановлении убихинон превращается в анион-радикал семихинона. Этот радикал нефермента-тивно взаимодействует с О₂ с образованием супероксидного радикала. Комплекс II на рисунке не указан.

Биохимия обмена веществ

I Научно-методическое обоснование темы:

12 3 4 Следующая ⇒