Тема 6 «Лабораторная диагностика рожи свиней и листериоза»

Цель – формирование практических умений проводить лабораторную диагностику рожи свиней и листериоза, формирование знаний о сущности и технике проведения бактериологических и серологических методов исследований, умений выделять биологические особенности возбудителя, работая с лабораторным оборудованием, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации, сопоставление биологических особенностей листерий и рожистой палочки.

План

1. Патологический материал для лабораторного исследования.

2. Бактериологические методы диагностики сибирской язвы.

3. Серологические методы диагностики сибирской язвы.

Материальное обеспечение: демонстрационные мазки листерий и возбудителя рожи свиней, биопрепараты (вакцины, гипериммунные сыворотки) против рожи свиней и листериоза; труп белой мыши в кювете, стерилизатор с инструментами (скальпели, ножницы, пинцеты), тампоны с 70 % спиртом, спички, микроскоп, предметные стекла, спиртовки, культуры музейных вакцинных штаммов грампозитивных палочек, выращенные на МПА и МПБ, набор красок для окрашивания по Граму. Таблицы («Схема бактериологической диагностики листериоза», «Схема бактериологического исследования на рожу свиней», «Дифференциация листерий от рожистой палочки»).

Теоретический материал

1. Бактериологическая диагностика листериоза включает микроскопическое исследование исходного материала, посевы на питательные среды, идентификацию выделенных культур по культурально-биохимическим, тинкториальным и серологическим свойствам, а также постановку биологической пробы на лабораторных животных.

Микроскопическое исследование. Микроскопическому исследованию подвергают мазки-отпечатки из головного мозга, внутренних органов и тканей. При приготовлении мазков-отпечатков чистым предметным стеклом 3-4 раза прикасаются к поверхности среза органа. Мазки готовят непосредственно из патматериала, а также после подращивания его проб при 37 °C в течение 4-6 часов. Мазки окрашивают по Граму, а также методами флюоресцирующих антител.

Возбудитель листериоза - Listeria monocytogenes - грамположительная подвижная неспорообразующая полиморфная, чаще палочковидная бактерия длиной 0,5 - 2,0 мкм.

Бактериологическое исследование. Из органов и обязательно головного мозга проводят обильные множественные посевы или предварительно готовят суспензию из головного мозга и паренхиматозных органов на физрастворе в соотношении 1:5 и из нее делают посевы. Для культивирования листерий используют обычные среды с добавлением 1% глюкозы и 2 - 3% глицерина или печеночный агар и бульон (pH среды 7,2 - 7,4), а также кровяной агар и элективные среды (Приложение 10.2).

В качестве дополнительного метода при отрицательном результате первичного посева рекомендуется часть исследуемого материала поместить в холодильник и хранить в течение 30 дней для проведения повторных исследований через каждые 10 дней.

При исследовании абортированных плодов посевы делают из содержимого желудка и внутренних органов.

При исследовании истечений из половых органов, молока и силоса посевы проводят на печеночный агар в чашках и МПБ с 10% хлорида натрия, из которого потом делают пересевы на твердые среды.

Посевы инкубируют в термостате при 37° с ежедневным просмотром в первые 3 - 4 дня. При отсутствии роста наблюдение за посевами проводят в течение двух недель.

Характерным для возбудителя листериоза является легкое помутнение бульона и появление мелких росинчатых колоний на агаре, наличие бета-гемолиза на кровяном агаре. Колонии листерий в проходящем свете имеют голубую окраску с зеленоватым оттенком и мелкозернистую структуру.

Из выделенной культуры делают мазки, окрашивая их по Граму, а также для люминесцентной микроскопии с применением прямого и непрямого метода флюоресцирующих антител.

Биологическое исследование проводят на 2 - 3 белых мышах (масса 14 - 16 г). Животных заражают под кожу или внутрибрюшинно суспензией из головного мозга и внутренних органов или культурой в дозе 0,3 - 0,5 мл. При положительной биопробе животные погибают через 2-6 суток после заражения. При вскрытии отмечают множественные некротические очажки в печени, селезенке, почках. В отдельных случаях этих поражений может не быть. При наблюдении более 10 дней рекомендуется дополнительно делать посев из головного мозга. Очень чувствительны к подкожному заражению 5- 6-дневные мыши-сосуны, которые гибнут через 18 - 36 часов.

К заражению листериями восприимчивы и кролики. Показательно внутривенное заражение кроликов культурой листерий в дозе 0,5 - 1 млрд. микробных тел (по стандарту мутности), при этом количество моноцитов в крови зараженных животных увеличивается в несколько раз. Это является дополнительной характеристикой возбудителя болезни.

Из внутренних органов (печень, селезенка, почки, сердце) павших животных делают мазки-отпечатки и высевы на питательные среды.

Срок наблюдения за подопытными животными - 14 суток.

Идентификация микробной культуры

Определение подвижности проводят методом висячей или раздавленной капли, а также посевом методом укола в полужидкий МПА. На подвижность исследуют 6-18-часовую бульонную культуру, выращенную при комнатной температуре (22 °C). Листерии, выращенные при данной температуре, обладают активной подвижностью.

Для определения ферментативных свойств чистую бульонную культуру пересевают на пестрый ряд (глюкоза, мальтоза, маннит, салицин, трегалоза, дульцит, инулин, раффиноза), который выдерживают при 37 °C в течение 10 дней. Листерии разлагают с образованием кислоты (без газа) глюкозу, мальтозу, трегалозу, салицин и не разлагают дульцит, инулин, раффинозу, маннит.

Проба на каталазу. К суточной бульонной культуре добавляют равный объем свежеприготовленной 5-процентной перекиси водорода, при исследовании агаровой культуры в пробирку вносят несколько капель перекиси водорода. При наличии фермента каталазы перекись водорода разлагается с образованием пузырьков газа (пена).

Способность выделять фермент каталазу является характерным признаком листерий при дифференциации от возбудителя рожи свиней.

Определяют чувствительности листерий к бактериофагам.

Культуру признают листериями, если в месте нанесения одного из бактериофагов образуется прозрачная зона лизиса или полусливной лизис (в виде губки). Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста вторичной культуры в зоне лизиса при интенсивном бактериальном росте на остальной поверхности агара. В месте нанесения капли стерильного бульона зона лизиса отсутствует.

Люминесцентно-серологическое исследование проводят с использованием прямого (ПМФА) и непрямого методов флюоресцирующих антител (НМФА). С помощью этих методов можно идентифицировать возбудителя в культурах, обнаружить листерии в органах и тканях, а также определить их серогрупповую принадлежность.

Для дифференциации листерий от возбудителя рожи свиней можно использовать индикаторные среды; метод основан на редукции и оксидации красок в средах при выращивании листерий.

Возбудитель рожи свиней не обесцвечивает ни одну из вышеуказанных сред.

Серологическая идентификация листерий.

Реакцию агглютинации ставят на чистых обезжиренных предметных стеклах. На предметное стекло наносят две капли: каплю поливалентной сыворотки и каплю физраствора. К обеим каплям на стекле добавляют по одной капле смыва культуры, смесь тщательно и быстро перемешивают бактериологической петлей или запаянным концом пастеровской пипетки, после чего стекла плавно покачивают круговыми движениями. Одновременно для контроля один раз в день исследуют на стекле каплю сыворотки с добавлением капли физраствора.

Учет результатов РА проводят в течение 3-х минут. Реакция считается положительной при появлении четкой агглютинации (образование хлопьев) в капле с сывороткой при ее отсутствии в контроле. Запоздалые реакции не учитывают.

Исследуемую культуру признают листериями при получении положительной реакции с поливалентной сывороткой и отсутствии агглютинации в контроле с физраствором, а также наличии характерных морфологических, культуральных и биохимических свойств.

Специфические свойства листерий проверяют также конъюнктивальной пробой на морских свинках или дермонекротической пробой на морских свинках или кроликах.

Конъюнктивальная проба. На конъюнктиву глаза морской свинки наносят 2 капли испытуемой бульонной культуры с последующим легким массажем век ватным тампоном. Вирулентные штаммы листерий на 2-4 день вызывают у морской свинки гнойный кератоконъюнктивит. Пробу с каждым штаммом желательно ставить не менее чем на двух морских свинках.

Дермонекротическая проба. В тщательно выстриженный участок кожи бока морской свинки или кролика внутрикожно вводят 0,3 - 0,5 мл бульонной культуры. Через 24 - 48 часов возникает воспаление с последующим некрозом и образованием струпа.

На одной морской свинке можно ставить конъюнктивальную и дермонекротическую пробу при изучении свойств одного штамма. При необходимости испытания нескольких культур в выстриженный участок кожи на правом и левом боку кролика можно инъецировать по 3 культуры с каждой стороны.

Диагноз на листериоз считается установленным при получении положительного результата РНФ; обнаружении листерий в патматериале иммунофлюоресцентным методом, а также при выделении грамположительной полиморфной подвижной палочки, образующей каталазу и разлагающей с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, трегалозу и салицин; вызывающей (вирулентные штаммы) положительные конъюнктивальную и дермонекротическую пробы у морских свинок и кроликов; дающей положительную РА с листериозной сывороткой; лизирующейся листериозным бактериофагом; обладающей патогенностью для лабораторных животных (вирулентные штаммы).

Диагноз на рожу свиней устанавливают на основании эпизоотологических данных (заболевание молодых свиней и поросят отъемного возраста, возникающее обычно в жаркое время года), клинических признаков (красные пятна на коже, имеющие форму различных геометрических фигур, высокая температура), данных вскрытия (катаральное и катарально-геморрагическое воспаление желудка и тонкого отдела кишечника, серозный перикардит, бородавчатый эндокардит, неравномерная окраска миокарда, венозный застой и кровоизлияния в почках), а также результатов бактериологических исследований патологического материала от больных и павших животных. Диагностика рожи свиней представлена в схеме 1 [3,7].

Диагноз на рожу свиней считают установленным окончательно в одном из следующих случаев:

- при обнаружении возбудителя рожи свиней в исходном патологическом материале методом люминесцентной микроскопии (без выделения чистой культуры);

- при выделении из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя болезни;

- при гибели зараженных животных и выделении из их органов культуры возбудителя, даже если в посевах из исходного материала культуры возбудителя не выделено.

При вскрытии не всегда удается определить причину смерти животного. На бактериологическое исследование посылают отдельные органы, части органов, кости или целые трупы мелких животных с нарочным. Во избежание распространения инфекции посылаемый материал должен быть завернут в мешковину, смоченную дезинфицирующим раствором, хорошо упакован в плотный деревянный или металлический ящик, выстланный полиэтиленом.

Целые трупы или органы отправляются для исследования в стеклянных банках, металлических ведрах или банках с крышками. В случаях, когда из-за дальности расстояния в свежем виде материал доставить невозможно, его консервируют в 30-%ном водном растворе глицерина.

Материал можно замораживать и в термосе со льдом доставлять в лабораторию. При этом следует учитывать, что материал должен быть доставлен в лабораторию не позднее 4-6 часов после гибели животного и от животных, которые при жизни не подвергались лечению. В противном случаи возможны диагностические ошибки.

При роже свиней для исследования берут целый труп или селезенку, измененные части органов (почки) и трубчатую кость, очищенную от мяса. Летом кусочки почек, селезенки и целиком лимфатические узлы, в 30-40 %м глицерине или в насыщенном растворе поваренной соли. Кровь посылают в запаянной пипетке. Пораженные участки кожи, трубчатую кость пересыпают сухой поваренной солью.

Бактериологическая диагностика

Для микроскопии готовят мазки-отпечатки из почек, селезенки, печени, пораженных участков кожи, сердца или из выделенной культуры возбудителя.

Для получения чистой культуры возбудителя рожи высевы из патологического материала проводят на обычные и элективные питательные среды. Обычно посевы делают на хорошо просветленных мясопептонных бульоне и агаре или бульоне Хоттингера при рН 7,4-7,8. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37^° С в течение 24-48 часов. Полученную культуру микроскопируют, изучают ее культуральные, биохимические свойства. Чистую культуру пересевают на полужидкий 0,2%-ный агар (для определения подвижности макрометодом), мясопептонную желатину, пептонную воду с полоской реактивной бумаги (для изучения возможности возбудителя выделять сероводород), на среды Гисса с углеводами, на индикаторные среды, в две пробирки с мясопептонным бульоном для проб на образование каталазы.

Дифференциальная диагностика

Рожу свиней дифференцируют от классической чумы, пастереллёза, листериоза, сибирской язвы, солнечного и теплового удара, а также веррукозных эндокардитов.

Серологическая диагностика

Из серологических методов диагностики применяют реакцию агглютинации (РА) в двух модификациях: пластинчатую и пробирочную, пробу роста. Некоторые исследователи рекомендуют использовать РНГА и РТГА. Однако не все перечисленные серологические реакции дают четкую зависимость между титром противорожистых антител и иммунной защитой. Срок лабораторного исследования, с целью постановки диагноза на рожу свиней, составляет 7 дней.

Обнаружение и идентификация возбудителя рожи свиней в чистых, смешанных культурах и патологическом материале определяют и с помощью люминесцирующей рожистой сыворотки.

Биопробу проводят на голубях и белых мышах. Заражают их в день поступления патологического материала суспензией в разведении 1:5, а затем суточной бульонной культурой. Заражение мышей производят подкожно в дозе 0,1-0,2 см³ , голубей - внутримышечно в дозе 0,2-0,3 см³. В случае положительного диагноза на рожу свиней мыши должны погибнуть через 3-4 суток, а голуби - через 2-5 суток. Наблюдение за зараженными животными и птицей проводят в течение 6 суток. Из органов павших мышей и голубей делают высевы на питательные среды с целью выделения чистой культуры возбудителя рожи свиней.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Составьте схемы проведения лабораторного исследования на листериоз и рожу свиней.

Этапы выполнения задания:

1 Отберите патологический материал для бактериологического и серологического исследований.

2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики болезней.

3 Определите необходимость и порядок выполнения серологического исследования биоматериалов.

4 Схему исследования зарисуйте в тетрадь.

Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства микробной культуры.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовьте мазки-препараты из музейных культур, зафиксируйте их.

2 Окрасьте мазки-препараты по методу Грама.

3 Микроскопируйте окрашенные препараты, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителей в тетрадь, отчитайтесь преподавателю.

Практическое задание 3: Определите культуральные свойства микробной культуры.

Этапы выполнения задания:

1 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПБ.

2 Опишите характер роста микробной культуры на среде МПА.

3 Проанализируйте культуральные свойства изученной микробных культур и сделайте заключение о соответствии ее листериям или рожистой палочке.

Практическое задание 4: Дифференцировать возбудитель рожи свиней от листерий.

Этапы выполнения задания:

1 Выяснить морфологические отличия возбудителей листериоза и рожи свиней.

2 Определить отличительные особенности ферментативной активности возбудителей болезни.

3 Установить восприимчивость лабораторных животных к возбудителям рожи свиней и листериоза.

4 Провести серологическую типизацию возбудителей.

5 Анализировать полученные результаты, сделать заключение и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 5: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при сибирской язве.

Этапы выполнения задания:

1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения.

2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату.

3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Какой материал направляют для исследования в лабораторию на рожу свиней? 2 Поясните порядок исследования биоматериала на рожу свиней. 3 Какими биологическими особенностями обладает возбудитель рожи свиней? 4 Назовите и охарактеризуйте биопрепараты, применяемые при роже свиней. 5 Какой материал направляют для исследования в лабораторию на листериоз? 6 Поясните порядок исследования биоматериала на листериоз. 7 Назовите отличительные особенности биологических свойств возбудителя листериоза от рожистой палочки. 8 Какие патогенные микроорганизмы необходимо дифференцировать от листерий и рожистой палочки? 9 Дайте характеристику биопрепаратам, применяемым при листериозе. 10 Поясните культуральные свойства возбудителя рожи свиней и листерий.

 

⇐ Предыдущая3456789101112Следующая ⇒

Поделиться: