Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


Тема 3 « Реакция связывания комплемента. Реакция иммунофлуоресценции»



Цель – формирование знаний о сущности, получении и подготовки компонентов, методиках постановки реакции связывания комплимента и ее разновидностей, методиках постановки реакции иммунофлуоресценции, умений оценивать результаты реакций, делать заключение об инфицированности животного патогенными микроорганизмами, навыков работы с источниками информации, сопоставление результатов серологических исследований.

План

1. Реакция связывания комплимента (РСК) и ее разновидности.

2. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), методы постановки.

Материальное обеспечение: свежие (без гемолиза) или консервированные фенолом, мертиолатом, борной кислотой сыворотки крови животных, антигены для РСК (стандартные антигены, выпускаемые биофабриками), диагностические специфические сыворотки, штатив с пробирками Флоринского, мерные пипетки, физ. раствор, люминесцентный микроскоп, исследуемый материал, люминесцирующая сыворотка в рабочем разведении, влажная камера, пипетки 1-2 мл, изотонический раствор натрия хлорида, дистиллированная вода. таблицы по теме занятия (Реакция связывания комплимента, Реакция иммунофлуоресценции).

Теоретический материал

Реакция связывания комплемента (РСК). Реакция связывания комплемента впервые описана Дж. Борде и О. Жангу в 1901году.

РСК – сложная двухэтапная реакция, в которой связывание антигена с антителом идет в присутствии третьего компонента (комплемента). Образовавшийся комплекс не видим, поэтому используют дополнительную индикаторную систему (гемолитическую) как цветной показатель.

РСК применяют для диагностики инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии (бруцеллёз, сап, листериоз, ящур, ИНАН и др.).

В диагностических лабораториях РСК используют в двух направлениях:

- обнаружение специфических антител в сыворотке крови больных с помощью стандартных антигенов.

- выявление в исследуемом материале специфического антигена (бактериального или вирусного) с помощью специфических иммунных сывороток.

Сущность реакции. В реакцию входят две системы:

1. бактериологическая (диагностическая);

2. гемолитическая (индикаторная).

Бактериологическая система (баксистема) представлена испытуемой сывороткой и антигеном, гемолитическая (гемсистема) – гемолизином и эритроцитами барана. Гемолитическая система позволяет установить, произошла реакция в первой системе или нет. Гемолизин и эритроциты по отношению друг к другу тоже являются антителом (гемолизин) и антигеном (эритроциты).

Комплемент занимает нейтральное положение и связывается с любой из систем, в которой образуется комплекс антиген-антитело. При наличии в испытуемой сыворотке антител, они вступают в реакцию с антигеном и комплемент связывается с образовавшимся комплексом в баксистеме. Гемолитическая система остается свободной, эритроциты барана оседают на дно пробирки в виде осадка, что указывает на положительную реакцию (отсутствие гемолиза). При отсутствии в испытуемой сыворотке специфических антител комплемент остается свободным, связывается с гемолитической системой и вызывает гемолиз эритроцитов барана (реакция отрицательная).

Подготовка к исследованию. Все компоненты готовят непосредственно перед постановкой реакции.

1. Исследуемые и контрольные сыворотки разводят физиологическим раствором 1:5, 1:10, инактивируют в водяной бане при 56-62°С (в зависимости от вида животного) 30 минут для освобождения от собственного комплемента.

2. Антигеном для РСК могут быть культуры убитых бактерий, их лизаты, экстракты из патологически измененных и нормальных органов, вирусы и вируссодержащие материалы, т.е. корпускулярные и растворимые антигены, не обладающие гемолизирующим свойством.

3. Комплемент –  это сыворотка крови морской свинки (как наиболее чувствительный активный комплемент), выпускают биофабрики в лиофилизированном виде. Перед каждой постановкой РСК его титруют (проверяют активность). Титр комплемента – это его оптимальное количество, необходимое для данной реакции.

4. Гемолизин – это сыворотка крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Готовят на биофабриках, на упаковке указывают его титр.

5. Эритроциты барана, их готовят в лаборатории. Отмытые эритроциты разводят 1:40.

Перед постановкой РСК титруют один или несколько следующих
компонентов антиген, гемолизин, комплемент. Какие компоненты
подлежат титрации указано в методических указаниях по диагностике
конкретной болезни. Цель титрации – определение предельного (фактического) титра компонента. Титрацию проводят методом последовательных разведений компонентов. После подготовки всех компонентов (включая титрацию необходимых из них) ставят главный опыт.

Главный опыт РСК

Порядок постановки реакции. Учитывая, что искомым является наличие антител в испытуемой сыворотке, постановку реакции начинают с баксистемы. Инактивированную и разведенную сыворотку (1:10) разливают в две пробирки по 0,5 мл. Следовательно, в штативы ставят два ряда пробирок с количеством пар, соответствующих числу исследуемых сывороток, плюс две пары (с нормальной – негативной и позитивной – положительной сыворотками) для контроля. Контроль должен быть всегда, независимо от количества исследуемых сывороток (даже одной пробы).

Во все пробирки первого ряда сывороток добавляют по 0,5 мл антигена, второго ряда (без антигена) – по 0,5 мл физиологического раствора.

Затем во все пробирки первого и второго рядов вносят по 0,5 комплемента, встряхивают и помещают в водяную баню (20-40 минут при 37-38 °С).

После водяной бани во все пробирки первого и второго рядов добавляют компоненты гемсистемы по 0,5 мл (гемолизин и эритроциты барана), встряхивают и вновь помещают в водяную баню при тех же режимах.

Учет и оценка реакции. Учет реакции начинают с контролей, при отсутствии их или, если они не работают, реакция считается не действительной.

РСК сопровождается следующими контролями:

- антигена;

- комплемента;

- гемолизина;

- эритроцитов;

- с позитивной сывороткой – заведомо положительный;

- с негативной сывороткой – заведомо отрицательный.

Задержка гемолиза должна наблюдаться только в контроле с позитивной сывороткой, в остальных гемолиз.

Результаты реакции оценивают визуально дважды:

- первый предварительный, сразу после водяной бани;

- второй окончательный – через 18-20 часов пребывания пробирок при комнатной температуре.

При первом учете обращают внимание на пробирки второго ряда и пробирки с нормальной сывороткой и антигеном, где начался гемолиз. В пробирках с позитивной сывороткой и антигеном гемолиз эритроцитов должен отсутствовать (эритроциты во взвешенном состоянии, жидкость мутная). Окончательный учет проводят на следующий день. Результаты РСК оценивают визуально в крестах:

+ + + + (#) – отсутствие гемолиза (полное осаждение эритроцитов), надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;

+ + +  – 25 % гемолиза эритроцитов, значительный осадок эритроцитов,

жидкость слегка окрашена в розовый цвет;

 + +  –  50 % гемолиза эритроцитов, осадок эритроцитов выражен,

жидкость розового цвета;

+  – 75% гемолиза эритроцитов, незначительный осадок, жидкость

интенсивно окрашена в красный цвет;

- –  100 % (полный) гемолиз эритроцитов жидкость интенсивно окрашена в красный цвет – «лаковая кровь».

Реакцию связывания комплемента считают положительной при оценке не ниже двух крестов.

РСК при бруцеллезе. Комплементсвязывающие антитела при бруцеллезе были обнаружены в 1908 году в сыворотке крови людей, больных мальтийской лихорадкой (бруцеллезом). Причем в качестве антигена применяли различные штаммы бруцелл.

Широкое применение РСК для диагностики бруцеллеза в нашей стране получила после того, как работами отечественных исследователей была установлена ее большая диагностическая ценность и некоторые преимущества по сравнению с реакцией агглютинации. Комплемент связывающие антитела в сыворотке зараженных животных появляются позднее, чем агглютинирующие. Поэтому отставание РСК от РА может быть на 10-15 суток (у овец), месяц и более (у коров). РСК в стадах с хронической инфекцией бруцеллеза выявляет большее количество реагирующих, чем РА. В нашей стране РСК для диагностики бруцеллеза животных используют с 1950 года. РСК с целью обнаружения специфических бруцеллезных антител в сыворотке крови животных применяют в следующих случаях:

- контроль благополучия хозяйств;

- исследование сыворотки крови от абортировавших коров;

- контроль напряженности иммунитета у вакцинированных животных

- во всех случаях подозрения бруцеллеза для установления диагноза.

Реакцию ставят в соответствии с методическими указаниями по диагностике бруцеллеза от 1996 года. Принцип постановки реакции является общим с некоторыми особенностями. Особенности РСК при диагностике бруцеллеза:

Сыворотки разводят 1:5, в качестве разбавителя используют физиологический раствор с добавлением солей хлористого магния и хлористого кальция, рН 7,3-7,4.

В качестве антигена применяют единый бруцеллезый антиген для РА, РСК и РДСК, который представляет собой взвесь убитых бруцелл трех видов (Br. abortus, Br. melitensis, Br. suis).

Реакцию ставят в пробирках в объеме 1 см3 по 0,2 см3 каждого компонента (сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина, эритроцитов барана) или в полистириловых пластинках с лунками.

Испытуемые сыворотки исследуют в разведениях 1:5 и выше с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Кроме того, контролем служат:

· негативная сыворотка + АГ – отрицательная реакция;

· позитивная сыворотка + АГ – положительная реакция;

· антиген в двойной дозе без сыворотки

Комплемент титруют в бактериологической системе. Титром комплемента считают его наибольшее разведение, давшее полный гемолиз 0,4 см3 гемолитической системы в присутствии негативной сыворотки и АГ в течение 20 минут в водяной бане (37-38°С).

Учет и оценка реакции. Результаты РСК или РДСК учитывают визуально через 4-6 часов после окончания постановки или на следующий день при условии хранения штативов с реакцией при температуре 4-8°С. Реакцию оценивают в крестах.

РСК и РДСК считают положительной при задержке гемолиза на 2-4 креста в одном или нескольких разведениях сыворотки (1:5 и выше) и полном гемолизе эритроцитов в контроле (без антигена).

Задержку гемолиза в один крест считают сомнительной реакцией и животных исследуют повторно через 15-30 дней. При этом животных, сыворотки крови которых, при повторном исследовании реагировали сомнительно в РСК (РДСК) считают реагирующими положительно.

Использование РСК в диагностике вирусных болезней

РСК применяют для диагностики многих вирусных болезней. Принцип постановки реакции остается тот же, различаются методы постановки в зависимости от цели исследования. Особенностью является то, что антиген довольно часто готовят непосредственно в лаборатории из органов больных (зараженных) животных, из алантоисной или амниотической жидкостей зараженных куриных эмбрионов, из жидкой среды инфицированных культур клеток. Подготовка антигена для РСК имеет свои особенности, что обусловлено рядом специфических свойств вирусов. При идентификации вирусов (антигена) в реакции используют стандартные специфические сыворотки, при обнаружении антител - стандартные антигены.

Модификации РСК. Реакция длительного связывания комплемента (РДСК) отличается от РСК тем, что связывание идет при температуре +4°С. Реакция Вассермана (РВ) применяется при диагностике сифилиса в медицине. В качестве антигенов применяют экстракты из печени или других органов зараженных возбудителем сифилиса лабораторных животных.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

Флуоресценция – видимое свечение некоторых веществ под воздействием облучения их ультрафиолетовыми лучами (УФЛ). Такие вещества называют флуорохромы. К ним относят акридин оранжевый, родамин, сульфохлорид и другие красители. Эти флуорохромы при внесении в иммунные сыворотки или гамма-глобулины прочно присоединяют к антителам. Антитела становятся «меченными», то есть издают свечение при облучении их УФЛ.

Сущность реакции и цель применения. Иммунофлуоресцентный метод основан на специфической реакции антигена с «меченными» флуорохромом антителами, результат которой можно увидеть в люминесцентный микроскоп.

Возможность данного метода определяется сочетанием специфичности серологических реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления реакции необходимо иметь высокоспецифичные иммунные флуоресцирующие сыворотки. В серологических реакциях, используемых в микробиологической практике, участвуют преимущественно три компонента: антиген, антитело и комплемент. Все три компонента обладают антигенными свойствами и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки, и, соответственно, флуоресцирующие антитела.

В зависимости от того, какого типа флуоресцирующая сыворотка использу­ется (против антигена, антител или комплемента) различают три основных варианта РИФ: прямой, непрямой варианты и модификация непрямого варианта с использованием комплемента.

Методы постановки реакции иммунофлуоресценции.

Прямой метод предложен Кунсом в 1950 году. Этот метод применяют для обнаружения бактерий и вирусных антигенов в патологическом материале, объектах внешней среды, и для идентификации возбудителей заболеваний в культурах.

Схема постановки прямой РИФ. На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки, а из органов и тканей – мазки-отпечатки. Препараты подсушивают и фиксируют ацетоном в течение 5 минут. Затем на препарат наносят люминесцирующую сыворотку и помещают его во влажную камеру при температу­ре 37 °С на 15-20 минут. Затем для удаления избытка флуоресцирующих антител препарат промывают изотоническим раствором натрия хлорида в течение 10-15 минут с последующим ополаскиванием в дистиллированной воде в течении 10 ми­нут. Сушат при комнатной температуре и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Непрямой метод (двухступенчатый) предложен Кунсом в 1954 году. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидовым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулином того вида животного, от которого была использована иммунная сыворотка.

Схема постановки непрямой РИФ. На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки первой ступени. Препарат помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15-20 минут. Затем промывают (см. прямой вариант), подсу­шивают и наносят каплю люминесцирующей антивидовой сыворотки. Препарат снова помещают в термостат в условиях влажной камеры на 15-20 минут. Повто­ряют процедуру промывания и высушивают фильтровальной бумагой.

Непрямой антикомплементарный (трёхступенчатый) вариант открыт в 1958 году. Непрямые варианты можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител.

Схема постановки трёхступенчатого варианта РИФ. Реакция идет в три этапа.

1 этап. На предметное стекло с исследуемым материалом наносят каплю иммунной немеченой сыворотки. Препарат помещают в термостат, как описано выше, подсушивают.

2 этап. На мазок наносят каплю комплемента. Препарат вновь помещают во влажную камеру и в термостат на 15-20 минут, после чего промывают.

3 этап. На препарат наносят люминесцирующую антикомплементарную сыворотку.

Обязательными в любой модификации РИФ являются три контроля:

1) обработка флуоресцирующими антителами суспензии

гомологических бактерий (положительный контроль);

2) обработка флуоресцирующими антителами суспензии

гетерологичной культуры (отрицательный контроль);

3) обработка флуоресцирующими антителами суспензии

незараженного материала (отрицательный контроль).

Оценка результатов. Необходимо учитывать яркость и цвет свечения. Интенсивность свечения оценивают по четырёхбалльной системе:

++++ - очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки;

+++ - яркая флуоресценция периферии клетки;

++ - слабое свечение периферии клетки;

+ - нет контрастного свечения периферии и тела микробной клетки.

Риф имеет ряд преимуществ:

- является экспресс-методом, позволяющим провести исследования в течение 2-3 часов.

- идентификацию можно проводить в нативном материале (органы, ткани животных), без выделения чистой культуры.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Провести исследование сыворотки крови животных реакцией связывания комплемента.

Этапы выполнения задания:

1 Оценить пригодность сывороток крови животных к серологическому исследованию.

2 Освоить постановку РСК с единым бруцеллезным антигеном.

3 Оценить результаты реакции, сделать заключение, отчитаться преподавателю.

Практическое задание 2: Освоить технику постановки РИФ прямым методом.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить мазки-отпечатки, подсушить их и зафиксировать ацетоном.

2 .Нанести на препарат люминесцирующую сыворотку и поместить его во влажную камеру при температу­ре 37 °С на 15-20 минут.

3 Промыть препарат, оценить результаты реакции, сделать заключение, отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 В чем заключается сущность РСК? 2 Назовите компоненты реакции, их значение. 3 Какова роль бактериологической и гемолитической систем в РСК? 4 Как проводят учет и оценку РСК? 5 С какой целью применяют РСК и ее разновидности в ветеринарной практике? 6 Поясните понятие «флуоресценция». 7 В чем заключается сущность реакции иммунофлуоресценции? 8 Назовите методы постановки РИФ, поясните их отличия. 9 Как проводят учет и оценку реакции иммунофлуоресценции? 10 Какие преимущества имеет реакции иммунофлуоресценции?


Поделиться:



Последнее изменение этой страницы: 2019-03-22; Просмотров: 585; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.055 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь