Тема 2 «Реакция агглютинации. Реакция преципитации»

Цель – формирование знаний о сущности, получения и подготовки компонентов, методиках постановки реакции агглютинации и ее разновидностей, методиках постановки реакции кольцепреципитации по Асколи, умений оценивать результаты реакций, делать заключение об инфицированности животного патогенными микроорганизмами, навыков работы с источниками информации, сопоставление результатов серологических исследований.

План

1. Общие сведения о серологических реакциях.

2. Реакция агглютинации (РА) и ее разновидности.

3. Реакция преципитации (РП), методы постановки.

Материальное обеспечение: свежие (без гемолиза) или консервированные фенолом, мертиолатом, борной кислотой сыворотки крови животных, антигены для РА (стандартные антигены, выпускаемые биофабриками), диагностические специфические сыворотки, штатив с пробирками Флоринского, мерные пипетки, физ. раствор, Сыворотка крови, кусочки паренхиматозных органов, кожи (5х5см) в сухом или загнившем состоянии, не обработанные дезинфицирующими средствами. Шерсть, волос, щетина (не менее 20-30 грамм). Пробирки с экстрагированным антигеном, с преципитирующей сывороткой гомологичной антигену, с нормальной сывороткой, чистые преципитационные про­бирки (Уленгута), тонкие пастеровские пипетки, резиновые груши, агар в колбах и водяная баня для расплавления агара, предметные стёкла, стерильные чашки Петри, эксикаторы, пробойник для создания углублений в агаре, таблицы по теме занятия (Реакция агглютинации, Реакция преципитации).

Теоретический материал

Серологическими называют реакции, для постановки которых используют сыворотку (serum), содержащую антитела. В основе всех серологических реакций лежит специфическое взаимодействие антитела с антигеном, в результате чего образуется комплекс антиген+антитело.

Антигены (АГ) – это генетически чужеродные для организма вещества и клетки, способные вызывать образование антител и другие формы иммунного ответа. К антигенам относятся также микробы и их токсины. В качестве антигена в серологических реакциях обычно участвуют как целые микробные клетки живые или убитые, так и отдельные их компоненты, продукты распада и токсины. В связи с этим различают антигены корпускулярные (частичковые) и растворимые, представляющие собой продукты распада, экстракты из разрушенных бактерий, токсины.

В составе микробной клетки содержатся разные антигены: капсульные (К-антиген), жгутиковые (Н-антиген), соматические (О-антиген) и др. Особенности антигенной структуры различных видов и вариантов микроорганизмов лежат в основе их серологической идентификации (серотипизации), а также учитываются при конструировании вакцин.

Антитела (АТ) – это особый вид белков, называемых иммуноглобулинами (Ig), которые вырабатываются в организме под влиянием антигенов и способные специфически реагировать с ними. Антитела накапливаются, в основном, в крови, содержатся в секретах слизистых оболочек, молоке, моче и других жидкостях организма, обеспечивая гуморальный иммунитет (humor

(лат.) – жидкость). Обнаружение специфических антител к определённому микробу – возбудителю свидетельствует о болезни, бактерионосительстве, или же характеризует состояние активного или пассивного иммунитета после вакцинации, введения иммунной сыворотки, передачи антител с молозивом или через желток яйца.

Серологические реакции используются в диагностических целях в двух основных направлениях:

Выявление больных животных или бактерионосителей путём обнаружения у них антител. В этом случае к исследуемой сыворотке (или другому материалу) добавляется стандартный, то есть известный антиген. Обычно это взвесь убитых микробов определённого вида или типа.

Определение вида или типа микробов, то есть серологическая идентификация. Для этого выделенную культуру микробов смешивают с известной (диагностической) сывороткой, содержащей антитела к определённому виду или типу возбудителя.

Серологические реакции применяют также для контроля напряжённости иммунитета (титров антител) после вакцинации или пассивной иммунизации.

Реакция между антигеном и антителом может проявляться по-разному (феномен реакции). Различают реакции осадочные, лизирующие и нейтрализующие.

Осадочные: реакция агглютинации, в которой происходит склеивание корпускулярного антигена соответствующими антителами агглютинами; реакция преципитации или осаждения растворимого антигена антителами преципитинами.

В реакциях лизиса участвуют антитела лизины, вызывающие растворение соответствующего корпускулярного антигена (бактериолизины, гемолизины и др.).

В реакции нейтрализации происходит обезвреживание (нейтрализация) токсического действия антигена (токсина) нейтрализующими антителами.

 

Общие закономерности серологических реакций:

реакции ставятся in vitro (в пробирках, лунках планшет, на стекле, в агаровом геле в чашках Петри и др.);

проявляются при соответствии (гомологичности) антигена и антитела;

протекают в две фазы:

а) специфическая – взаимодействие антигена с антителом;

б) неспецифическая – образование видимого комплекса антиген-антитело (иногда для этого в реакцию вводят дополнительные системы). 

Для определения родовой, видовой или типовой принадлежности антигена необходимы заведомо известные иммунные диагностические сыворотки. Их получают путём многократного введения животным в нарастающих дозах убитых или живых микроорганизмов, продуктов их распада, обезвреженных или нативных токсинов. После накопления в крови достаточного количества антител проводят кровопускание и получают сыворотку, которую консервируют, проверяют на активность (титр антител) и стерильность, разливают в ампулы.

Реакция агглютинации (РА) – одна из первых серологических реакций, которую применяют в микробиологической практике. Впервые реакцию применил Ф. Видаль (1895) для диагностики брюшного тифа. Позже (1897) эту реакцию для диагностики бруцеллёза у людей использовал А. Райт. В ветеринарной практике данную реакцию применяют для диагностики бруцеллёза, сальмонеллёзов, лептоспироза, листериоза, кампилобактериоза, микоплазмоза и пуллороза птиц, типизации возбудителя колибактериоза, а также для типизации неизвестных культур микробов по заведомо известной агглютинирующей сыворотке.

Сущность реакции. Реакция агглютинации (agglutination – склеивание) проявляется в склеивании микробов (клеток) при действии на них специфических антител с образованием комочков, хлопьев и последующим выпадением их в осадок (агглютинат). Характер агглютината зависит от антигенного строения микробной клетки. Если антигеном является взвесь неподвижных бактерий (без жгутиков), имеющих только соматический О-антиген, образуется мелкозернистый осадок в течение 16-24 часов. Если антигеном служит взвесь подвижных бактерий (Н-антиген), формируется крупнохлопчатый рыхлый осадок в более короткий срок.

Методы постановки РА: классический (пробирочный), капельный (пластинчатый), кровекапельная реакция агглютинации (ККРА), розбенгалпроба (РБП), кольцевая реакция с молоком (КР), реакция микроагглютинации (РМА), реакция гемагглютинации (РГА) и её разновидности.

Материал исследований. Для определения антител (по известному антигену) используют свежие (без гемолиза) или консервированные фенолом, мертиолатом, борной кислотой сыворотки крови животных.

Антиген для РА представляет собой взвесь убитых или живых бактерий в физиологическом растворе. Обычно используют стандартные антигены, выпускаемые биофабриками.

Если же требуется идентифицировать бактериальную культуру, выделенную из биоматериала, применяют стандартные диагностические сыворотки, а антиген готовят из суточной микробной культуры – смыв с агаровой среды.

Классический (пробирочный) метод

В зависимости от вида диагностируемого заболевания готовят соответствующие разведения сывороток (согласно инструкции). Это объясняется различным содержанием в сыворотке разных видов животных нормальных антител, которые будут искажать результаты реакции. Например, для диагностики бруцеллёза крупного рогатого скота сыворотки разводят 1:50, 1:100, 1:200, 1:400.

Вначале готовят исходное (основное) разведение 1:25,смешивая 0,1 мл испытуемой сыворотки с 2,4 мл физиологического раствора. В опытные пробирки наливают по 1 мл физиологического раствора. Затем из пробирки с основным разведением сыворотки переносят 1 мл в первую опытную пробирку и смешивают с физиологическим раствором (разведение становится 1:50). Далее, 1мл переносят во вторую пробирку (1:100), из второй – в третью 1мл и т.д. Из последней пробирки 1мл смеси удаляют (для выравнивания объёма).

Во все пробирки с разведениями сыворотки, кроме основного, добавляют по две капли стандартного антигена (концентрация 10 млрд микробных тел в 1 мл), смешивают встряхиванием, выдерживают в термостате 4-6 ч при 37ºС, а затем при комнатной температуре 14-16 ч, после чего учитывают результат.

При постановке РА обязательны контроли:

отрицательный – в тех же разведениях исследуют нормальную (отрицательную) сыворотку (от заведомо здорового животного) с тем же антигеном;

положительный – в тех же разведениях исследуют позитивную сыворотку (положительную) – от заведомо больного животного или стандартную (биофабричного производства) с тем же антигеном;

контроль антигена – с целью исключения самоагглютинации в1мл физиологического раствора (без сыворотки) добавляют 2 капли антигена;

контроль качества испытуемой сыворотки – пробирка с основным разведением испытуемой сыворотки.

Учёт и оценка реакции. Проводят визуально в каждой пробирке, начиная с контрольных. Результаты РА выражают в крестах (плюсах) в зависимости от степени выраженности осадка и просветления жидкости:

++++ (#) – полное просветление жидкости, на дне пробирки осадок из склеенных микробных клеток в виде перевёрнутого зонтика. При лёгком встряхивании осадок разбивается на хлопья, комочки. При этом жидкость остаётся прозрачной. (100% агглютинация);

+++ – неполное просветление жидкости (опалесценция) и хорошо выраженный «зонтик». (75% агглютинация);

++ – слабое просветление жидкости, «зонтик» умеренно выражен. (50%           агглютинация);

+ – едва заметное просветление жидкости, «зонтик» выражен слабо, при встряхивании обнаруживают небольшое количество хлопьев, комочков.

(25% агглютинация);

- – просветление жидкости и «зонтик» отсутствуют. Может наблюдаться небольшой осадок в виде точки из осевших несклеенных микробов, который при встряхивании разбивается в равномерную взвесь.

При большинстве болезней оценку агглютинации на два, три и четыре креста признают положительной реакцией. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается данная реакция, считается её титром. Диагностическую оценку реакции проводят с учётом выраженности в крестах и по высоте её титров.

Капельный (пластинчатый) метод РА применяют для:

1) ориентировочной типизации (идентификации) вида микроба. На предметное стекло наносят каплю известной специфической сыворотки и отдельно каплю физиологического раствора (контроль). Бактериологической петлей в каждую каплю вносят испытуемую микробную культуру (исследуемый материал) и равномерно размешивают.

2) массовой диагностики хронических инфекционных болезней животных (например, бруцеллеза). В этом случае исследуемым материалом служит сыворотка крови животных. В отрицательном контроле используют сыворотку крови здоровых животных, в положительном – специфическую биофабричную сыворотку. Во все капли сывороток добавляют специфический антиген. Сыворотки крови животных, давшие положительную реакцию, далее исследуют классическим методом РА с целью определения титра антител.

Учет реакции проводят в течение двух минут, визуально.

Положительная реакция – жидкость в капле просветляется, хорошо заметна агглютинация в виде комочков сероватого цвета. Положительная реакция свидетельствует о гомологичности антигена и антитела.

Отрицательная реакция – жидкость остается равномерно мутной, без комочков (агглютинация отсутствует). В контроле должна быть отрицательная реакция.

Роз-бенгал проба (РБП). Реакция применяется при исследовании сывороток крови при диагностике бруцеллёза у крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, верблюдов, маралов, северных оленей. Роз-бенгал проба характеризуется быстротой и простотой выполнения, высокой специфичностью.

Материалы и оборудование. Исследуемая сыворотка крови, стекла или эмалированные диагностические пластины с лунками, микропипетки, антиген бруцеллёзный цветной для роз-бенгал пробы – суспензия бруцелл в буферном растворе (рН 3,6), инактивированных нагреванием и фенолом, окрашенных бенгальским розовым в малиново-розовый цвет, позитивная сыворотка, негативная сыворотка.

Сущность РБП заключается в том, что при добавлении сыворотки крови, содержащей специфические антитела к определенному (известному) антигену, в равномерной взвеси клеток происходит их склеивание, образование хлопьев и просветление жидкости.

Порядок постановки реакции. РБП проводят при температуре 18-3 0°С на чистом стекле или сухой эмалирован­ной диагностической пластине с лунками. Цельную (не разведенную) исследуемую сыворотку крови в дозе 0,03см³ микропипеткой вносят на край дна лунки. При исследовании крови крупного рогатого скота, верблюдов и лошадей в каждую лунку рядом с сывороткой вносят 0,03 см³ антигена, а при исследовании сыворотки крови овец, коз, свиней и северных оленей – 0,015 см³ антигена. Затем антиген смешивают с сывороткой осторожным вращательным движением.

Контроль:

1) положительный – антиген + позитивная сыворотка;

2) отрицательный – антиген + негативная сыворотка;

3) контроль антигена на спонтанную агглютинацию – антиген + физиологический раствор.

Оценка результатов. Роз-бенгал пробу считают положительной при наличии выраженной агглютинации антигена в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, наступающей в тече­ние четырех минут. Реакцию агглютинации, появляющуюся позже четырех минут, не учитывают.

Все сыворотки, с которыми получена положительная РБП, в тот же, или на другой день исследуют в РА и РСК для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих антител.

Реакция преципитации (РП). Преципитация (от латинского слова praecipitatio – сбрасывание, падение вниз) – это реакция осаждения из коллоидного раствора комплекса антигена (преципиногена) под влиянием антител (преципитинов) иммунной сыворотки. Итальянский учёный А. Асколи в 1910 году предложил метод постановки реакции, при котором раствор антигенов и антител наслаивается в пробирке без смешивания; при этом между фазами возникает серовато-белый диск осадка – «коль­цо». Отсюда название – реакция кольцепреципитации. В 1946 году Оудин предло­жил метод простой диффузии в агаровый гель. В 1948 году Оухтерлони предложил метод двойной диффузии в агаровый гель (в чашках или на пластинках). В 1959 году Вязов – метод двойной диффузии в агаровый гель в капиллярах. В 1953 году Экли и Фултрон – метод двойной диффузии в агаровый гель в пробирках.

Сущность реакции и цель применения. РП – это реакция коллоидного типа. При соединении соответствующих преципи­тинов (АТ) и преципитиногенов (АГ) происходит образование комплекса антиген-антитело и выпадение осадка (преципитат).

РП отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет не только выявлять малые количества белкового антигена (1:1 000 000), но и устанавливать его принадлежность.

РП – один из наиболее простых иммунологических методов исследования. В ветеринарной практике её используют для диагностики ряда инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы. В ветеринарно-санитарной экспертизе – при выявлении фальсификации мясных, рыбных и растительных изделий. В судеб­ной медицине и ветеринарии – для установления видовой принадлежности белка крови и т. д.

РП применяют с диагностической целью для обнаружения антител в сыворотке крови обследуемого животного, а также с целью идентификации выделенных от животных микроорганизмов и тканевых антигенов.

Материал исследований. Сыворотка крови, кусочки паренхиматозных органов, кожи (5х5см) в сухом или загнившем состоянии, не обработанные дезинфицирующими средствами. Шерсть, волос, щетина (не менее 20-30 грамм). Мясо, рыба, молоко, растительные продукты.

Компоненты реакции. Пробирки с экстрагированным антигеном, с преципитирующей сывороткой гомологичной антигену, с нормальной сывороткой, чистые преципитационные про­бирки (Уленгута), тонкие пастеровские пипетки, резиновые груши, агар в колбах и водяная баня для расплавления агара, предметные стёкла, стерильные чашки Петри, эксикаторы, пробойник для создания углублений в агаре.

Подготовка материала к исследованию. Антигены (преципитиногены) представляют собой ультрамикроскопические частицы белково-полисахаридной природы; экстракты из микроорганизмов, органов и тканей; продукты распада бактериальных клеток, их лизаты; фильтраты патологи­ческого материала. Преципиногены резистентны к нагреванию (кипячению, автоклавированию) и гниению. Существуют физические и химические методы получения антигенов.

Физические методы:

а) Механические.

Густую массу отмытых физиологическим раствором бактериальных клеток растирают в стериль­ной ступке с песком или стеклянным порошком, затем наливают небольшое коли­чество нейтрального физиологического раствора, центрифугируют (или фильтруют) до получения прозрачной жидкости, которую используют как антиген. 

б) Замораживание и оттаивание взвеси бактерий.

Это приводит к разрушению клеточной стенки и выходу протоплазмы в раствор. После центрифугирования надосадочную жидкость (антиген) используют в работе.

в) Метод звуковых колебаний.

Применяют специальные аппараты с особым зуммером. Прибор погружают внутрь жидкости с взвесью бактерий и включают. Клетки разрушаются (как при действии ультразвука).

г) Кипячение.

Бактериальную взвесь (или измельчённую ткань) в физиологическом растворе кипя­тят 1-2 часа, фильтруют через асбестовую вату.

Химические методы:

Для разрушения бактерий в условиях производства биопрепаратов, а также в на­учных целях используют аутолиз бактериальных клеток, их разрушение фермента­ми, высушиванием в ацетоне и др.

Преципитирующие сыворотки получают путём гипериммунизации кроликов, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Титр преципитирующей сыворотки определяется максимальным разведением антигена, который преципитируется данной сывороткой. Это объясняется тем, что преципитиноген, участвующий в РП, содержит в единице объёма гораздо больше частиц, чем антител в преципитирующей сыворотке такого же объёма. В связи с этим преципитирующие сыворотки выпускают с титром не ниже 1:100 000.

Порядок постановки реакции.

Метод смешивания антигена с сывороткой.

Берут 10 преципитационных пробирок, в 9 из них наливают по 0,2 мл цельной (ли­бо разведенной 1:2) преципитирующей сыворотки. Отдельно готовят десятикратные разведения в физиологическом растворе исследуемого антигена от 1:10 до 1:10 000 000. По 0,2 мл каждого разведения добавляют в семь пробирок с иммун­ной сывороткой. В восьмую пробирку (контроль преципитирующей сыворотки) до­бавляют 0,2 мл физиологического раствора, а в девятую – 0,2 мл гетерологичного антигена или стерильной среды (контроль специфической сыворотки). В десятую пробирку на­ливают 0,2 мл нормальной сыворотки и 0,2 мл разведенного в 10 раз антигена (отрицательный контроль). Все пробирки встряхивают до полного смешивания жид­кости и помещают в термостат при температуре 37°С на два часа, затем выдерживают в рефрижераторе при 0-5°С (или при комнатной температуре) 18 -20 часов.

Учет реакции. При положительной реакции на дно пробирок выпадают хлопья преципитата.

Метод кольцепреципитации

В узкие пробирки Уленгута (диаметр 0,4-0,5см), держа в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке разливают одинаковое количество (по 0,3-0,4 мл) спе­цифической преципитирующей сыворотки и антигена. Технику постановки реакции осуществляют либо наслаиванием антигена на сыворотку, либо подслаиванием сыворотки под антиген (чтобы не произошло смешивания, так как сыворотка тяжелее антигена). Специфичность реакции проверяют контролями сыво­ротки и антигена.

Контроль сыворотки. На иммунную сыворотку в отдельных пробирках наслаи­вают: в одну пробирку 0,1 мл физиологического раствора, в другую – 0,1 мл стерильной среды, на которой готовился антиген, в третью пробирку –0,1 мл гетерогенного антигена.

Для контроля антигена в отдельные 2-3 пробирки разливают нормальную сыворотку того же вида животного, от которого получена преципитирующая сыворотка, сверху добавляют по 0,1 мл антигена, оставляют при комнатной температуре и учитывают через 1-2 минуты.

Учет реакции. Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 минут, 1-2 часа или через 20-24 часа.

В положительном случае на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

Реакция считается положительной:

1 Если диск (кольцо) преципитата появляется вскоре после наслаивания антигена (или подслаивания сыворотки) через несколько минут (не позже 1-2);

2 Если в контрольных пробирках реакция отрицательная – нет преципитата (кольца).

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Провести исследование сыворотки крови животных реакцией агглютинации.

Этапы выполнения задания:

1 Оценить пригодность сывороток крови животных к серологическому исследованию.

2 Освоить постановку РА классическим методом с единым бруцеллезным антигеном.

3 Освоить постановку РА пластинчатым методом с антигеном для розбенгал пробы.

4 Оценить результаты реакции, сделать заключение, отчитаться преподавателю.

Практическое задание 2: Провести исследование кожевено-мехового сырья реакцией преципитации с целью диагностики сибирской язвы.

Этапы выполнения задания:

1 Подготовить пробы кожевенно-мехового сырья к серологическому исследованию.

2 Освоить постановку РП методом кольцепреципитации с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой.

3 Оценить результаты реакции, сделать заключение, отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Как проявляется РА и от чего зависит характер осадка (агглютината)? 2 Назовите методы постановки РА, в чем сходство и отличие этих методов? 3 Как проводят учет и оценку реакции при постановке разными методами? 4 Назовите компоненты РА, опишите методику получения антигена. 5 Какие контроли необходимы при постановке РА и почему? 6 Дайте определение понятия «преципитация». 7 Перечислите методы получения антигенов. 8 Укажите материал для проведения исследования. 9 Назовите методы постановки реакции преципитации.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: