Тема 4 «ДНК-ДНК гибридизация, ПЦР»

Цель – формирование знаний о сущности и значении современных методов генетической диагностики вирусных болезней у животных, умений проводить подготовку биоматериалов к исследованию, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации, лабораторным оборудованием и инструментами, сопоставление полученных результатов проведенных исследований.

План

1. ДНК-ДНК гибридизация.

2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

3. Учебный фильм ПЦР

Материальное обеспечение: микробные культуры, мультимедийное оборудование, таблицы по теме занятия (Постановка ПЦР).

Теоретический материал

Метод ДНК-ДНК гибридизации с использованием нитроцеллюлозных фильтров позволяет определить гомологию нуклеотидных последовательностей ДНК не только на уровне родов, но и видов одного рода. Для идентификации и дифференциации микроорганизмов наряду с морфологическими, культуральными и биохимическими признаками широко используют результаты изучения молекулярной структуры нуклеиновых кислот. Исследование нуклеиновых кислот позволяет получить полную характеристику о микроорганизме, так как первичная последовательность ДНК содержит информацию о структурных и энзиматических белках, определяющих фенотип организма. Кроме того, последовательность и число нуклеотидных замен ДНК отражают происхождение и развитие организма.

Этапы проведения исследования:

1) Культивирование микроорганизмов, получение биомассы.

2) Выделение ДНК микроорганизма. ДНК выделяют в два этапа: разрушение клеточной стенки и последующая экстракция нуклеиновых кислот из лизата.

3) Определение нуклеотидного состава микробного штамма по температуре плавления ДНК. Нуклеотидный состав исследуемого штамма определяют спектрофотометрически по тепловой денатурации.

4) Молекулярная гибридизация ДНК. В качестве реперного штамма (штамма сравнения) используют референтные штаммы с известными характеристиками. Гибридизацию проводят 48 часов.

5) Учет реакции ДНК-ДНК гибридизации. Учет степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК проводят, принимая за 100% радиоактивность гомологичной реакции. Микроорганизмы относят к определенному виду в случае содержания ГЦ пар – 58-59 мол. % и 90-100 % гомологии нуклеотидных последовательностей с ДНК реперного штамма микроорганизма.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод, позволяющий обнаружить нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК) вируса в любом материале с точностью до одной молекулы.

ПЦР состоит из нескольких этапов, которые проводятся в специальных помещениях. Сотрудники лаборатории, участвующие в ПЦР – диагностике, работают в одноразовой стерильной спецодежде, которую сменяют на каждом этапе реакции.

1 этап – подготовка проб проводится в боксе. Обработку материала проводят в ламинарном шкафу, в стерильных условиях. Дополнительно непосредственно перед работой все поверхности протирают салфеткой, смоченной 70% этиловым спиртом.

Из биоматериала готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию тщательно перетирают в ступке со стеклянным порошком до получения гомогенной массы и отстаивают 15 минут для осаждения крупных частиц суспензии. Микродозатором суспензию переносят в одноразовую пластиковую пробирку объемом 1,5 мл. Для каждой пробы используют одноразовый наконечник с аэрозольным барьером. Суспензию ценгрифугируют при 10 тыс. об/мин. 30 секунд с целью осаждения грубых частиц тканей и осветления суспензии.

Пробирка с суспензией передается в соседнее помещение через специальное окно для дальнейшей работы.

Все рабочие поверхности в ламинарном шкафу вновь обрабатываются 70% спиртом.

2 этап – выделение нуклеиновых кислот проводится в специальном боксе, оснащенным необходимым оборудованием, одноразовыми расходными материалами и спец. одеждой. Набор реактивов включает: лизирующий раствор, отмывочные растворы под номерами 1, 3, 4 и РНК-элюэнт. Перед работой все рабочие поверхности, оборудование обрабатывают спиртом.

В штатив устанавливают две одноразовые пластиковые пробирки (для исследуемой пробы и отрицательного контроля), нумеруют их. В каждую пробирку микродозатором вносят 450 мкл лизирующего раствора, затем в первую – исследуемый материал, во вторую – физ. Раствор в объемах по 100 мкл. Содержимое пробирок тщательно и быстро перемешивают на вортексе. Протеаза и комплекс солей, входящие в лизирующий раствор, разрушают весь белок пробы до аминокислот. Нуклеиновые кислоты вируса остаются в неизменном виде.

Отделение нуклеиновой кислоты от лизирующего раствора проводят специальным сорбентом, который добавляют по 2,5 мкл в каждую пробирку. Сорбент предварительно перемешивают на вортексе. Пробы дважды ресуспендируют на вортексе и оставляют на 5 минут в штативе для окончания процесса сорбции нуклеиновой кислоты. Сорбент осаждают путем центрифугирования проб при 10 тыс. об/мин. В течение 30 секунд. Вакуумным отсасывателем с одноразовыми наконечниками удаляют надосадочную жидкость из обеих пробирок. Осадок двукратно последовательно отмывают растворами №1,3,4. Пробы ресуспедируют на вортексе, центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют. В каждую пробирку с подсушенным сорбентом вносят по 25 мкл раствора РНК элюэнта, ресуспендируют на вортексе, центрифугируют при 12-13 тыс.об/мин. в течение 1 минуты. В результате нуклеиновая кислота переходит в буфероный раствор. Надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновую кислоту, микродозатором переносят в чистую пробирку. Пробирки маркируют и передают в следующее помещение.

3 этап – амплификация (главный этап ПЦР) проводится в специально оборудованном помещении, отдельным персоналом.

Процесс амплитфикации представляет собой многократное копирование специфического для каждого вида возбудителя фрагмента ДНК. Количество фрагментов увеличивают на столько, что их можно обнаружить методами электрофореза или ДНК-зондов. В аплификации используют только ДНК возбудителя. Поэтому выделенную РНК переводят в ДНК реакцией обратной транскрипции.

Методика проведения реакции обратной транскрипции. В пробирку с реакционной смесью (буферный раствор + нуклеотиды+ фермент обратной транскриптазы) вносят выделенную РНК. Реакция протекает в термостате при температуре 37ºС 30 минут. Фермент обратной транскриптазы (ревертаза) выстраивает из нуклеотидов реакционной смеси цепь ДНК на исходной молекуле нуклеиновой кислоты. Полученная копийная ДНК для постановки ПЦР разводится в 5 раз ДНК буфером и может храниться при температурах -16ºС неделю, -70ºС один год.

Проведение амплификации. В четыре пробирки с реакционной смесью №1 (праймеры) вносят реакционную смесь №2(ДНК-полимераза + нуклеотиды для постановки ДНК) в объеме 10 мкл. Восковая подушка разделяет реактивы смесей и не позволяет запустить реакцию. Затем вносят по 1 капле масла для ПЦР, чтобы исключить испарение компонентов смеси во время реакции. На минеральное масло или под него вносят по 10 мкл:

- в пробирку №1 – копийную ДНК исследуемой пробы;

- в пробирку №2 – отрицательный контроль этапа выделения нуклеиновой кислоты;

- в пробирку №3 – положительный контроль – к ДНК с РНК вируса;

- в пробирку №4 –отрицательный контроль ДНК-буфер.

Реакцию проводят в амплификаторе Ампли-4 производства «Биоком». Сначала устанавливают программу, обеспечивающую необходимую температуру реакции. Пробирки помещают в ячейки только после нагрева амплификатора до температуры 95ºС, закрывают крышку и запускают программу. Время амплификации составляет 1 час 50 минут – 2 часа 30 минут, что составляет 35-42 цикла. В течение каждого цикла проходят следующие этапы: плавление ДНК, отжиг праймеров и построение специфического фрагмента. В результате амплификации образуется примерно 100 миллионов копий специфического фрагмента.

4 этап – анализ продуктов ПЦР проводится в специальном помещении, расположенном как можно дальше от других объектов с целью исключения заноса летучих продуктов ПЦР в реакционные смеси.

Анализ проводят методом электрофореза. Приготовленный агарозный гель заливают в форму камеры для электрофореза толщиной 0,6 см. После застывания агара под буферный раствор в лунки вносят продукты амплификации последовательно из четырех пробирок. Камеру подключают к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется всегда к + электроду). Электрофорез длится 18-20 минут. Затем буферный раствор сливают, а гель переносят на стеклянную пластину и помещают на транс иллюминатор.

 На мониторе компьютера с помощью видеосистемы получают изображение геля. Учет результатов проводят по наличию или отсутствию электрофореграмме специфических светящихся полос амплифицированной ДНК. Начинают с контролей. На дорожке «+» контроля должна быть светящаяся полоса, а на дорожке «-» контроля –нет.

На более современных амплификаторах (Био-ред «Циклер») амплификация и анализ её результатов объединены в одном этапе. Результаты анализа продуктов амплификации в этом случае выводятся на монитор компьютера в виде графических кривых, соответсвующих контролям и исследуемой пробе. Это позволяет сократить время анализа, затраты на оборудование, отпадает необходимость дополнительного помещения.

В учебном фильме Вы познакомитесь с техникой проведения полимеразной цепной реакцией (ПЦР). В фильме представлено одно из направлений деятельности Челябинской межобластной лаборатории - диагностика вирусных болезней животных.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Провести подготовку микробных культур к исследованию в реакции ДНК-ДНК гибридизации.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить из микробной культуры мазок-препарат, окрасить по Граму, микроскопировать.

2 Определить форму микробных клеток и чистоту культуры.

3 В случае обнаружения смешанной микробной культуры, выделить чистую культуру общепринятыми методами.

4 Провести посев чистой микробной культуры с целью накопления биомассы.

Практическое задание 2: Усвоить технику постановки полимеразной цепной реакци (ПЦР).

Этапы выполнения задания:

1 Внимательно посмотреть учебный фильм.

2 Выделить основные этапы проведения ПЦР.

3 Обсудить методику постановки ПЦР, подвести итоги занятия.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 С какой целью применяют генетические методы диагностики в микробиологической практике? 2 на чем основан метод ДНК-ДНК-гибридизация? 3 Перечислите этапы проведения ДНК-ДНК-гибридизации. 4 Как определяют нуклеотидный состав микроорганизмов? 5 Как проводят учет и оценку реакции ДНК-ДНК-гибридизации? 6 В каких условиях проводят ПЦР? 7 Перечислите этапы проведения ПЦР. 8 В чем состоит методика проведения реакции обратной транскрипции? 9 Дайте определение понятия «амплификация». 10 С какой целью применяют метод электрофореза в ПЦР?

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: