Тема 11 «Лабораторная диагностика бруцеллеза»

Цель – формирование практических умений проводить лабораторную диагностику бруцеллеза, формирование знаний о сущности и технике проведения прижизненной и посмертной диагностики, умений выделять биологические особенности возбудителя, работая с лабораторным оборудованием, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации, сопоставление биологических особенностей бруцелл разных видов.

План

1. Патологический материал для лабораторного исследования.

2. Бактериологические методы диагностики бруцеллеза.

3. Серологическая диагностика бруцеллеза.

4. Аллергическая диагностика бруцеллеза.

Материальное обеспечение: пробы сыворотки крови крупного рогатого скота, позитивная и негативная (изготовленные на биофабрике), пробы молока по 2 мл, бруцеллезный антиген для розбенгал пробы, антиген бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком, единый бруцеллезный антиген для РА, РСК, РДСК, пластины для постановки розбенгал пробы, гемолизин, культура бруцелл (вакцинный штамм) на агаре, микроскопические препараты – мазки, окрашенные по методам Козловского и Грама, биопрепараты диагностические, вакцины шт. 19, 82, Рев – 1. Готовые результаты РА и РСК, предметные стекла, пастеровские пипетки стерильные, тампоны с 70% спиртом, микроскоп, растворы красителей для окраски по методам Козловского и Грама, пробирки; пипетки градуированные, стерильные емкостью 1 и 0,1 мл; единый бруцеллезный антиген, спиртовка, кювета с “мостиком”, вода дистиллированная. Таблицы (Мофология бруцелл; Схема лабораторной диагностики бруцеллеза; Дифференциация видов бруцелл; Схема постановки РА; Схема постановки РСК).

Теоретический материал

Бруцеллез — хрони­ческая инфекционная болезнь животных и человека, проявля­ющаяся абортами, эндометритами, задержанием последа, орхитами, рецидивирующей лихорадкой, у лошадей — преиму­щественно бурситами в области холки и воспалением связок затылочного сустава. В. ovis вызывает эпидидимит у баранов, яловость, аборты и рождение нежизнеспособных ягнят. Возбудитель относится к роду Brucella, который включает 6 видов: В. abortus —возбудитель бруцеллеза круп­ного рогатого скота; В. melitensis —овец и коз; В. suis — сви­ней; В. canis—собак; В. neotomae— кустарниковых крыс; В. ovis — инфекционного эпидидимита баранов.

Лабораторные методы диагностики – бактериологический и серологический.

В лабораторию направляют абортированный плод с плод­ными оболочками или желудок плода с содержимым, кусочки печени, селезенки, содержимое гигром, абсцессов, молоко; от убитых животных — лимфоузлы, кусочки паренхиматозных органов, костный мозг, матку, яичники, семенники, вымя; от баранов—семенники с придатками.

На серологическое исследование направляют кровь или сыворотку крови и молоко.

Бактериоскопия. Мазки фиксируют на пламени, окрашивают по Граму и Козловскому. При микроскопии учи­тывают, что бруцеллы — мелкие, грамотрицательные бакте­рии, окрашивающиеся по Козловскому в красный цвет.

Бактериологическое исследование. Посевы из патологического материала производят на ПГГБ, ПГГА, МППБ, МППГГА, картофельный агар. С целью подавления посторонней микрофлоры в среды можно добавлять гепцианвиолет (1:200000) или кристаллвиолет (1:100000). При ис­следовании материала от крупного рогатого скота одну часть посевов инкубируют в атмосфере с содержанием 10-15% СО₂. Выделение культур В. ovis проводят на плотных или полужидких печеночно-сывороточном или печеночно-амино-пептидном агарах в атмосфере с 10-15% СО₂. Посевы поме­щают при температуре 37-38°С и инкубируют 30 дней.

Культуры бактерий, обладающие типичными морфологи­ческими, тинкториальными и культуральными свойствами, дающие положительную РА с позитивной сывороткой, отно­сят к бруцеллам.

Виды бруцелл дифференцируют по способности роста в отсутствие повышенной концентрации СО₂, выделению НS₂, чувствительности к фагу Тб, бактериостатическому действию анилиновых красителей и агглютинации моноспецифическими сыворотками.

Таблица 17 – Дифференциация видов бруцелл

Виды бруцелл	Потреб-ность  в СО2	Образо-вание H2S	Рост в средах с красителями		Агглютинация моноспеци­фическими		Ли­зис фагом Тб
			Основной фуксин  (1:50 000)	Тионин (1:25 000)	А	М
В. abortus	+	+	+	-	+	-	+
В. suis	-	+	- (интенсивно)	+	+	-	-
В. ovis	+	-	+	+	-	-	-
В. neotomae	-	+	-	-	+	-	-
В. canis	-	-	-	+	-	-	-
B. melitensis	-	-	+	-	-	+	-

Биопроба. Проводят ее на морских свинках (не менее двух), сыворотка которых в разведении 1:5 отрицательно реа­гирует в РА с бруцеллезным антигеном. На 15, 25 и 40-й день после заражения берут кровь и сыворотку, исследуют в про­бирочной РА в титрах от 1:10 до 1:80. Результат на бруцел­лез считается положительным, если сыворотка реагирует в титре 1:10 и выше.

Для выделения культуры свинок убивают и делают по­севы из лимфоузлов, селезенки, печени и костного мозга.

Серологические методы. Для диагностики бру­целлеза животных применяют реакцию агглютинации в про­бирках (РА), реакцию связывания комплемента (РСК), реак­цию длительного связывания комплемента (РДСК), пластинчатую реакцию агглютинации с роз бенгал антигеном (роз бенгал проба, РБП) и кольцевую реакцию с молоком (КР).

РА ставят в объеме 1 мл с единым бруцеллезным антиге­ном для РА, РСК и РДСК. Сыворотки крови овец, коз, буй­волов, оленей и собак исследуют в разведениях 1:25, 1:50, 1:100, 1:200; крупного рогатого скота, лошадей и верблю­дов—1:50, 1:100, 1:200 и 1:400. РА считают положительной при наличии агглютинации с сыворотками крови крупного ро­гатого скота, лошадей и верблюдов, начиная с разведения 1:100 (100 ME); овец, коз, буйволов, оленей и собак—с 1:50 (50 ME) с оценкой не менее чем на 2 плюса. Сомнительной — при наличии агглютинации только в разведении 1:50 (50 ME) с сыворотками крови крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов и 1:25 (25 ME)—с сыворотками овец, коз, буй­волов, оленей и собак с оценкой не менее чем на 2 плюса.

РСК— специфический и высокочувствительный метод ди­агностики бруцеллеза животных. Ее показания более посто­янны и длительней сохраняются: комплементсвязывающие ан­титела появляются позже, чем агглютинины. Эта реакция позволяет выявить большее количество больных в стадах с давней инфекцией. РСК применяют при диагностике бруцелле­за у вышеперечисленных животных, а также свиней.

РДСК - более чувствительный тест, чем РСК - при инфек­ционном эпидидимите баранов используют только РДСК с овисным антигеном. РСК и РДСК считают положительными при задержке гемолиза на 2-4 плюса в одном или двух разведениях (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без антигена). Сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один плюс.

РБП используют для исследования сывороток крови круп­ного рогатого скота, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и оленей. Реакцию ставят при температуре 18 - 2О°С с бруцеллезным антигеном, окрашенным бенгальским розовым, на пластинках с лунками. При положительной реак­ции в течение 4 мин появляются мелкие или крупные хлопья агглютината розового цвета.

КР ставят с цельным свежим или консервированным фор­малином молоком коров и антигеном — взвесью убитых бру­целл, окрашенных в синий цвет гематоксилином. При нали­чии в молоке специфических антител происходит агрегация антигена, образовавшийся комплекс адсорбируется сливками молока и поднимается с ними вверх, образуя четкое, окра­шенное кольцо. Проводится реакция в уленгутовских пробир­ках, в которые вносят по 0,05 мл антигена, добавляют 1 мл молока, и содержимое тщательно смешивают. Реакция про­ходит при температуре 37—38 °С в течение 1 ч. Результаты учитывают визуально и оценивают в плюсах: «+ ++»— чет­ко выраженное синее кольцо в верхней части молока, осталь­ная часть молока белая, «++» — достаточно выраженное си­нее кольцо, столбик молока синеватого цвета. Пробы, давшие реакцию с оценкой 3 и 2 плюса, считают положительными. Эту реакцию рекомендуют для проверки благополучия стад (ферм) по бруцеллезу крупного рогатого скота и молока на рынках.

Для выявления бруцелл непосредственно в патологическом материале, а также в объектах внешней среды предложен прямой метод иммунофлюоресценции (РИФ), непрямой же метод позволяет обнаружить антитела в сыворотке крови больных, переболевших или привитых животных.

Аллергический метод. Для аллергической диагно­стики бруцеллеза овец, коз и свиней используют бруцеллин ВИЭВ, изготовляемый из неагглютиногенного и авирулентного штамма В. abortus В-1. У овец и коз применяют пальцебралыную пробу, свиньям препарат вводят внутрикожно с на­ружной стороны ушной раковины. У животных, больных бру­целлезом, на месте введения бруцеллина развивается воспа­лительная реакция.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Составьте схему проведения лабораторного исследования на бруцеллез.

Этапы выполнения задания:

1 Отберите патологический материал для бактериологического и серологического исследований.

2 Определите последовательность и технику выполнения бактериологических методов диагностики.

3 Определите порядок выполнения серологического исследования биоматериалов.

4 Схему исследования зарисуйте в тетрадь.

Практическое задание 2: Определите морфологические и тинкториальные свойства вакцинного штамма бруцелл.

Этапы выполнения задания:

1 Окрасьте фиксированные мазки-препараты по методам Грама и Козловского.

2 Микроскопируйте окрашенные препараты, зарисуйте и опишите морфологические особенности возбудителя в тетрадь, отчитайтесь преподавателю.

Практическое задание 3: Исследуйте пробу молока на бруцеллез кольцевой реакцией.

Этапы выполнения задания:

1 Внесите необходимое количество молока в пробирку.

2 Внесите бруцеллезный антиген для КР, перемешайте содержимое пробирок и поместите пробирки в термостат.

3 Проведите учет и оценку результатов КР, сделайте заключение.

Практическое задание 4: Проведите серологическое исследование сыворотки крови животных на бруцеллез РБП.

Этапы выполнения задания:

1 Нанесите две капли сыворотки (контрольную и опытную) на пластину.

2 Внесите антиген для РБП в каждую каплю, проведите визуальный учет реакции.

3 Зарисуйте результаты реакции в контрольной и опытной пробах.

Практическое задание 5: Проведите контроль биологических препаратов, применяемых при бруцеллезе.

Этапы выполнения задания:

1 Определите назначение биологического препарата (диагностические, профилактические, лечебные), способ применения.

2 Определите пригодность препарата к использованию, обратите внимание на срок годности препарата, целостность упаковки, соответствие содержимого ампулы (флакона и др.) описанию в наставлении к препарату.

3 Полученные результаты внесите в таблицу рабочей тетради, проанализируйте и сделайте заключение по каждому препарату.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Поясните правила и технику отбора патологического материала для серологической и бактериологической диагностики бруцеллеза. 2 Поясните порядок диагностических исследований на бруцеллез животных в лаборатории. 3 Какие методы бактериологического исследования биоматериала на бруцеллез применяют в лаборатории, в чем их сущность? 4 Каким методом определяют патогенность бруцелл? 5 В чем особенности проведения биопробы при лабораторной диагностике бруцеллеза? 6 Назовите методы серологической диагностики бруцеллеза. 7 Какое практическое значение имеет кольцевая реакция с молоком? 8 С какой целью применяют РБП? 9 Какими культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами обладают бруцеллы? 10 В чем сущность серологической диагностики бруцеллеза?

⇐ Предыдущая891011121314151617Следующая ⇒

Поделиться: